基于第三代单分子测序技术的科属特异性DNA条形码研究

The DNA barcodes have been widely used in the identification of medicinal plants and Chinese medicinal materials. However, up to date, some species still can’t be identified using general DNA barcodes. Our group has many successful experience in the study of DNA barcodes and chloroplasts. In this study, we will development novel species and genus-specific DNA barcodes for these unidentified species through the long DNA amplicon sequencing with the 3rd generation sequencing platform, the single molecule, real-time (SMRT) technology. These species and genus-specific DNA barcodes are powerful complements to traditional DNA barcode, and they will improve our DNA barcode identification system of medicinal plants and traditional Chinese medicine. The SMRT technology has a lot of advantages, such as long read length, quick speed, high throughput and low costs. Here we will sequence the long DNA amplicons amplified from 28 species of Fritillaria using SMRT technology, and then the amplicon sequences are aligned and clustered to screen out DNA fragments with species-specific variation information as candidate species and genus-specific DNA barcodes. These candiate DNA barcodes are verified by PCR amplification and sequencing. This study aims to establish a standard procedure of screening species and genus-specific DNA barcodes. The species and genus-specific DNA barcodes will provide novel references for the molecular evolution research of the species which are difficult to identify. In addition, these DNA barcodes also have great potentials in the identification of the fake and “daodi” Chinese medicinal materials.

DNA条形码技术已广泛应用于药用植物和中药材的鉴定，但是目前仍有一些物种无法利用通用DNA条形码进行鉴定。基于课题组在DNA条形码和叶绿体基因组方面的长期研究成果，本研究提出通过第三代单分子实时测序技术对长DNA扩增子进行测序和分析，发掘专门针对这些难鉴定科属的新DNA条形码。这些科属特异性DNA条形码是对传统DNA条形码的有力补充，将进一步完善我们建立的药用植物和中药材DNA条形码鉴定体系。本研究以贝母属为例，充分利用单分子实时测序读长长，速度快，通量高，成本低的优点，对28种贝母属药用植物DNA长片段扩增子进行大规模平行测序，通过对测序结果的聚类和比对分析，筛选包含种属特异性变异信息的片段作为贝母属特异性DNA条形码，并通过DNA扩增和测序验证新条形码的有效性。种属特异性DNA条形码不但可为难鉴定植物类群的分子进化研究提供参考，而且在中药材混伪品与道地药材的鉴定方面具有巨大的应用潜力。

研究背景：贝母属Fritillaria是百合科Liliaceae中的一个大属，贝母属共有约130个物种。已有研究表明，贝母属植物可能处于激烈分化的物种形成阶段，部分物种的分类存在很多争议，同一物种在不同地区因植物形态和花部特征出现差异，而被划分为不同物种。由于贝母属植物的这些特征，其形态学鉴定和现有分子鉴定都存在一定的困难。此外，由于贝母属药材市场需求量大，川贝母的价格昂贵等原因，贝母属药材的使用长期存在混伪品滥用的情况。因此，筛选用于鉴定贝母属植物的DNA条形码，对于贝母属药材的临床用药、质量控制具有重要意义。.主要研究内容：本研究发掘专门针对这些难鉴定科属的新DNA条形码，科属特异性DNA条形码是对传统DNA条形码的有力补充，将进一步完善现有的中药材DNA条形码分子鉴定体系。本研究以贝母属植物为例，构建种属特异性DNA条形码筛选鉴定体系。.重要结果及关键数据：本研究通过对贝母属物种叶绿体基因组进行全局分析，分别查找基因区域和基因间区的高变异区域，筛选用于高效鉴定贝母属植物的新DNA条形码序列。研究发现贝母属植物叶绿体的基因区域序列相似度极高，不适用于DNA条形码鉴定研究；共有7个基因间区可以作为贝母属植物鉴定的特异性DNA条形码。.科学意义：本研究构建的DNA条形码筛选方法，为筛选难鉴定科属的新DNA条形码提供了通用的方法体系。