基于地黄属及其近缘属的植物通用DNA条形码研究

DNA barcoding, as a rapid and accurate technique for species discrimination with short DNA fragment, has been a hotspot in biotaxonomy, but there are still debates on which DNA region can be used as the standard barcode for land plants, and research of DNA barcode in closely related genus of Rehmannia and Triaenophora has not been reported. In this study, five candidate DNA barcodes rbcL, matK, trnH-psbA, ITS and ITS2 would be evaluated by molecular biology, bioinformatics and other methods in order to obtain DNA barcode in Rehmannia and Triaenophora, and the feasibility of DNA barcoding among closely related species would be also discussed, which would supply theory basis for screening of DNA barcode and species discrimination in plant, furthermore provide more precise and reliable method to identify herbal medicine from medicinal plant in Rehmannia and Triaenophora.

DNA条形码是一种利用短DNA片段对物种进行快速而准确鉴定的技术，已成为全球生物分类学研究的热点。植物DNA条形码的研究尚处于寻找合适基因片段的阶段，而关于DNA条形码在地黄属及其近缘属植物的研究尚未见报道。本项目旨在通过分子生物学、生物信息学等手段，比较和评价rbcL、matK、trnH-psbA、ITS、ITS2片段及其不同组合在地黄属和崖白菜属植物的辨别能力，获得适合地黄属和崖白菜属植物分类的DNA条形码，探讨DNA条形码在近缘物种分类的适用性，以期为植物DNA条形码的筛选、物种鉴定提供理论依据，也为以地黄属和崖白菜属药用植物为基源的中药材鉴定提供更加准确可靠的手段。

DNA条形码是一种利用短DNA片段对物种进行快速而准确鉴定的技术，本项目对rbcL、matK、psbA-trnH、ITS、ITS2序列在地黄属及其近缘属的辨别能力进行了研究。通过引物筛选、PCR扩增优化及扩增效率的比较，确立了目的序列的PCR反应条件、通用引物，而且目的序列的测序成功率、有效序列获得率达到100%，但是部分ITS序列需要结合ITS2序列进行校对。与rbcL、matK、psbA-trnH序列相比，ITS、ITS2序列具有较高的变异率和较多的信息位点，且变异位点主要表现为嘌呤与嘌呤之间、嘧啶与嘧啶之间的碱基置换。遗传距离分析结果表明ITS2序列具有较高的种间多样性和较低的种内变异，且其种内种间距离相差较大，而rbcL和matK序列的种内种间差异小。通过Wilcoxon signed rank tests检验发现各目的序列种间遗传变异存在极显著差异，而且ITS2序列的变异极显著大于其他序列，但是ITS2序列的种内变异极显著低于ITS、psbA-trnH序列。利用MEGA5.0软件构建各目的序列的系统树，发现地黄属、崖白菜属分别单独构成一支，能明显地区分开。以ITS序列、ITS2序列构建的系统树显示，地黄属植物又明显分化为三大支，在psbA-trnH序列构建的系统树中，地黄栽培种、野生种聚类在一起，能够与地黄属其他种类区分开。进一步将ITS2序列和psbA-trnH序列组合，发现ITS2+psbA-trnH序列有较高的种间差异和较低的种内差异，且其种内种间遗传距离分布有明显的barcoding gap，有利于分类鉴定。另外，结合ITS2 database数据库中的资源，预测、分析了ITS2序列的二级结构及motif，发现ITS2二级结构的种间差异明显大于种内差异，亲缘关系较近物种的ITS2二级结构相似，但是种间ITS2的motif碱基序列相对保守。本研究成果对于研究DNA条形码在近缘物种分类的适用性具有重要的意义，为植物DNA条形码筛选、物种鉴定提供了参考资料，也为以药用植物为基源的中药材鉴定提供了理论依据。