大肠杆菌K1外膜蛋白A特异结构在其导致新生儿细菌性脑膜炎中的作用研究

E. coli K1 is one of the major causitive pathogens of neonatal bacterial meningitis. As a key pathogenic factors of E. coli K1, Outer membrane protein A (OmpA) helps E.coli K1 induce host bacterimia and puncture the blood-brain barrier, which plays an important role in the infectious disease process. To clarify the relationship betweent the structure of bacterial pathogenic factor and the pathogenic effects is the basis of revealing the bacterial pathogenic mechanisms and treating infectious diseases. In preliminary study we determined the crystal strucuture of OmpA and found that OmpA forms a specific domain swapped dimer structure. In order to further clarify the relationship between the specific structure and the pathogenic effects of OmpA, we plan to answer the question by homologous recombination, cell and animal experiments, which help understand the pathophysiological pathogenic mechanisms of the bacterial neonatal meningitis caused by E. coli K1 and provide a theoretical basis for the study of new method and drug target for treatment of E.coli K1 infection.

大肠杆菌K1（E.coli K1）是引起新生儿细菌性脑膜炎及相关感染性疾病的主要病原菌,外膜蛋白A（outer membrane protein A, OmpA）作为其关键致病因子，在介导细菌引发宿主菌血症和入侵血脑屏障并引发感染性疾病过程中发挥重要作用。阐明细菌致病因子结构与其致病效应的关系是揭示细菌致病机制和治疗感染疾病的基础。课题组前期解析了OmpA的晶体结构，发现了E.coli K1的OmpA形成特异的结构域交互二聚体（domain swappeddimer）结构。为进一步揭示OmpA该特异结构在其致病效应中的作用，本研究拟通过同源重组、体外分析、细胞试验和动物实验等技术和手段分析该结构的变化对其介导的宿主菌血症和入侵血脑屏障作用的影响，以期阐明OmpA介导E.coli K1引发新生儿细菌性脑膜炎致病效应的机制，为研究E.coli K1新的治疗措施和药物靶点提供依据。

本课题严格按照计划书执行，课题研究研究人员分工按照申请书进行，开展过程中无新增和退出。.本课题目前完成了下列工作：成功构建了E.coli K1 ompA 缺失/回复突变菌株, 通过血浆生存实验发现了domain swapped dimer 结构与E.coli K1的抗血浆杀伤作用密切相关；通过C4BP结合实验发现该抗血浆杀伤能力是通过降低与C4BP蛋白结合力造成的；建立了E.coli K1诱导新生大鼠细菌性脑膜炎模型，并在此模型上观察到了E.coli K1野生型和突变株毒力的差异；通过伊文思蓝染色试验发现了domain swapped dimer结构与细菌入侵血脑屏障密切相关；通过分析脑内组织的细胞因子、HE病理切片染色，脑脊液蛋白含量、脑脊液白细胞计数，发现了domain swapped dimer与细菌介导的脑膜炎密切相关。综上所述，本阶段的实验在E.coli K1诱导新生大鼠动物模型的基础上，进一步证实了OmpA swapper dimer的结构在OmpA介导细菌感染效应中发挥的重要作用。部分研究结果以题为《Biochemical and Functional Characterization of the Periplasmic Domain of the Outer Membrane Protein A from Enterohemorrhagic Escherichia coli》已经发表在Microbiological Research上。.在人才培养方面：课题研究培养博士研究生1名，王海光，已完成博士论文答辩，论文题目为：肠出血性大肠杆菌O157：H7外膜蛋白A及Tir-欧联细胞骨架蛋白功能研究。硕士研究生1名，方瑶，目前已经转为硕博连读研究生。此外在课题执行期间，课题组长顾江前往美国南加州大学开展合作研究1年。.本课题研究的关键问题在于动物模型的构建。由于E.coli K1 感染主要涉及新生儿，所以在构建模型中需要使用新生的动物如新生大鼠、小鼠等。由于新生的小鼠的免疫力低些，容易受到环境因素的影响。虽然我们在动物实验上取得一些结果，但是还需要在后续的研究中进行改进。