金属硫蛋白对衰老心肌中α-酮戊二酸脱氢酶硝化损伤的调控机制研究

Oxidative and nitrative stress is a direct factor to cause myocardial damage, and plays a critical role in the occurrence of age-associated myocardial diseases. Metallothionein (MT) as a non-specific antioxidant, which significantly protects oxidative and nitrative stress associated myocardial dysfunction. However, the mechanism of signal transduction and network regulation of this process remains unknown. Previous proteomics studies on the MT-TG aged-mice (cardiac-specific overexpression of MT) showed that MT obviously inhibited age-induced 3-NT modifications of α-oxoglutarate dehydrogenase (α-KGD) in the heart. Moreover, α-KGD is a necessary component of α-oxoglutarate dehydrogenase complex, which is an important enzyme complex and plays an important role in numerous metabolic pathways in the organism. Therefore, it suggests that MT may regulate the nitration level of α-KGD to improve cardiac energy supply, reduce myocardial apoptosis and prevent age-associated myocardial dysfunction. The purpose of this project is to understand how MT regulates the nitration level of each tyrosine residue of α-KGD. Site-directed mutagenesis and in vitro recombinant protein expression systems will be introduced to identify the effects of each nitrated tyrosine residue on the activity ofα-KGD, which will be expected to explore the relationship between the protection mechanism of MT on age-associated myocardial diseases and nitrative damage. The achievement of this subject will not only provide a theoretical basis for clinical therapy but also exploit a new method for the diagnosis of age-associated myocardial diseases.

氧化硝化损伤在心肌衰老过程中扮演重要的角色，非特异性抗氧化分子金属硫蛋白（MT）可显著抑制氧化硝化诱导的心肌功能退行性衰变，改善心肌功能。但MT对衰老心肌的作用机制尚不清楚。前期通过蛋白质组学技术对心肌MT特异高表达的衰老小鼠研究发现，MT可显著抑制衰老心肌中α-酮戊二酸脱氢酶（α-KGD）的硝化水平，而α-KGD又是体内能量代谢的关键酶，是维持心肌正常生理功能的必要因素之一，提示MT可能通过调控α-KGD的硝化水平，改善心肌的能量供应，从而减少心肌细胞的凋亡，发挥其对衰老心肌的保护作用。本课题旨在前期实验基础上进一步研究MT对衰老心肌中α-KGD硝基化修饰酪氨酸位点的调控，并通过体外表达、定点突变和动物体内转染检测各硝基化修饰位点对靶酶活性和亚细胞定位的影响，以期深入探索MT对衰老心肌保护机制与硝化损伤的关系。本项研究结果不仅能在理论上指导临床，而且有望开辟延缓心肌衰老方法的新篇章。

心脏特异性高表达金属硫蛋白可以延长寿命，但是其保护衰老伴随的慢性心血管疾病的潜在作用机制仍然不是很明朗。在本研究中，我们将使用两种金属硫蛋白高表达的雄性小鼠：MT-1以及MM，分别过表达金属硫蛋白60倍及20倍，并覆盖三个具有代表性的年龄范围：2-3个月，9-10个月以及18-20个月。分别使用超声心动图评价心脏的收缩舒张功能，使用组织切片染色技术观察心肌纤维状态，使用免疫印迹技术从炎症因子，衰老因子，凋亡因子的变化情况分析金属硫蛋白对衰老小鼠模型心肌病的保护作用，有助于我们了解金属硫蛋白高表达对衰老心肌保护作用，为金属硫蛋白的合理临床应用提供理论和实践基础。包括HE以及天狼猩红染色的组织病理观察及超声心动图的检测揭示衰老导致的心肌肥大，重构以及功能衰退能被MT有效的逆转。MT的过表达同时明显的降低衰老标记物SA-β-gal的活性以及细胞周期抑制因子的表达，并一同抑制促炎性因子的表达。当在心肌细胞中体外给予TNF-α，则大大的升高的细胞内ROS的产量并激活ROS依赖的NF-κB信号通路。除此之外，一些衰老伴随的性状也出现在TNF-α处理的心肌细胞中。这些效应在MT过表达的H9c2MT7心肌细胞中则没有出现。.免疫印迹技术联合基于质谱的靶向蛋白质组学技术分析发现，α-KGD在衰老的小鼠心肌中以及TNF-α处理的心肌细胞中均被明显的硝基化，并伴随KGDHC活性的下降以及能荷的衰退，但是MT能明显的逆转该情况，不论是在心肌组织中还是体外心肌细胞中。这些研究结果表明，MT作为有效的自由基清除剂，能够明显的降低体内的ROS水平并抑制ROS依赖的NF-κB信号通路激活。更重要的是，MT能保护炎症诱导的α-KGD硝基化损伤，在衰老心肌中维持正常的能量代谢从而改善衰老心肌病的病症。