通窍活血汤脑神经保护作用的效应物质基础及作用机制的研究

通窍活血汤是是清代名医王清任的活血化瘀经典名方，由麝香、桃仁、红花、赤芍、川芎等中药组成,有活血祛瘀，通络开窍之效,主治头面部血瘀之证。临床上对中风（脑梗死、脑供血不足）等疾病的防治及症状的改善有较好的疗效。我们前期的实验从细胞水平及整体脑缺血模型动物验证了其显著的脑神经功能损伤保护作用。本课题在前期研究工作的基础上，拟通过建立神经细胞色谱生物法，对通窍活血汤的脑神经保护作用的效应物质基础及作用机制进行分析：将通窍活血汤的提取液和神经细胞共同培养，利用细胞膜上的效应靶点和提取液中的成分特异性结合，并运用色谱分析技术对此成分进行鉴定、提取分离，对获得的效应成分进行神经功能损伤的细胞水平和整体脑缺血模型动物的药效学验证。阐明通窍活血汤脑神经保护作用的效应成分及作用机制，为临床用药提供科学依据。为中药制备工艺优化、质量标准控制等中药新药创制的关键性技术研究提供科学依据。

本课题采用神经细胞生物色谱法分析通窍活血汤和神经细胞特异性结合的效应成分，并对效应成分进行细胞水平的神经保护的药效学验证、体外对血脑屏障通透性的影响及整体脑缺血动物神经保护的机制研究。旨在沟通复方神经保护作用与效应物质基础之间的关系，为明确中药复方制剂的质量控制性成分提供针对性的实验依据。按照项目任务书，完成了以下相关的研究工作：.1.建立了通窍活血汤及其组成单味药材的提取液的HPLC指纹图谱，为效应成分的分析提供依据。.2.本研究建立了神经细胞生物色谱法，分别从通窍活血汤和神经细胞孵育的时间、洗脱方式的选择、洗脱液的组成及洗脱次数的确定、解离液样品处理条件等方面对神经细胞生物色谱法进行了优化。.3.利用神经细胞生物色谱法筛选出通窍活血汤和PC12细胞膜效应靶点有2个特异性结合的成分：通过液相、气相色谱分析，分别为麝香酮、藁本内酯来自麝香、川芎药材。.4.对效应成分进行了神经保护作用药效学验证及作用机制的研究。结果显示：麝香酮、藁本内酯对谷氨酸损伤的PC12细胞有显著的保护作用，能改善谷氨酸损伤的PC12细胞的形态，增强的PC12细胞的增值活性，减少细胞LDH释放。并对麝香酮的神经保护作用及通透血脑屏障机制进行研究：麝香酮提高活细胞比率；改善谷氨酸损伤PC12细胞的超微结构，降低细胞凋亡率及PC12细胞Bax的表达，增加Bcl-2的表达。原代培养了大鼠星形胶质细胞，并将其与ECV304细胞共培养建立体外血脑屏障模型，分析麝香酮透过血脑屏障机制。麝香酮能通过BBB模型，其机制与促进血脑屏障紧密连接开启无直接关系，而是与其抑制P-gp P-gp和MMP-9表达有关。从整体水平，对TQHXD抗脑血动物作用及机制进行探讨：TQHXD能显著延长双侧颈总动脉并迷走神经结扎所致脑缺血小鼠的存活时间；能显著延长断颅小鼠的喘气时间；降低结扎双侧颈总动脉所致脑缺血小鼠脑部毛细血管的通透性；对反复缺血再灌注小鼠，能降低脑含水量及脑指数，并能降低脑组织中MDA的含量，提高SOD酶、Na+,K+-ATPase Ca2+-ATPase 活力作用。TQHXD能明显改善脑缺血所致血管性痴呆大鼠的学习、记忆功能，改善脑组织海马CA1区的椎体细胞的病理形态的异常，对脑缺血所致血管性痴呆大鼠有改善作用。机理与提高VD大鼠脑皮质Ach的含量、降低脑皮质NO、ET-1、LPO的含量，减少海马区细胞凋亡有关。