P57调控细胞自噬在肝癌发生发展中的作用及其机制研究

The role of autophagy in happening and devlopement of cancer have important valve,and its regulation mechanism is current research hotspot. Recent research shows that: CDK inhibitors induction of cell cycle arrest and cofilin phosphorylation of the cell autophagy plays an important role. Our initial study found: CDK inhibitors p57 induced hepatocellular carcinoma cell cycle arrest, and the subject of PTEN regulation; P57 influence LIMK1 regulation cofilin phosphorylation. Prompt P57 as the key link of PTEN 's autophagy regulation , through the LIMK1 / Cofilin access control cell autophagy. This topic proposed by slow virus transfection technology building p57 stable/cut hepatocellular carcinoma cell lines, transmission electron microscopehepatocellular carcinoma cell autophagy change; Combined with DEN induced mice HCC model, analysis p57 autophagy relations in the process ofhepatocellular carcinoma; Using Western Blot, Q - PCR and animal model further discussed p57 and autophagy specific gene Beclin - 1, LC3 and PTEN/PI3K/AKT/mTOR path correlation, clarify p57 control cell autophagy in HCC occurrence and development of the functions and mechanism,to provide theoretical basis and experimental basis to explore HCC treatment of new targets , has important scientific significance and application value.

自噬对肿瘤发生发展具有重要意义，其调控机制备受关注。新近报道：CDK抑制剂诱导的细胞周期阻滞及cofilin的磷酸化在自噬中发挥重要作用。结合我们前期研究：CDK抑制剂P57诱导细胞周期阻滞抑制肝癌细胞增殖；调控LIMK1/cofflin途径影响肝癌细胞侵袭。因此我们推测P57可能通过LIMK1/Cofilin通路调控肝癌细胞自噬，发挥抑癌作用。本课题拟采用慢病毒转染技术构建P57稳定上/下调肝癌细胞系，透射电镜观察肝癌细胞自噬改变；结合DEN诱导小鼠肝癌模型，分析癌变过程中P57与肝癌自噬的关系；利用Western Blot、Q-PCR及动物模型进一步探讨P57与LIMK1/Cofilin通路、自噬特异性基因Beclin-1、LC3及自噬相关通路之间关系，阐明P57调控细胞自噬在肝癌发生发展中的作用及机制，为探寻HCC治疗的新靶点提供实验依据和理论基础，具有重要的科学意义和应用价值。

既往研究表明，CDK抑制剂诱导的细胞周期阻滞及cofilin的磷酸化在自噬中发挥重要作用；EGFR受体拮抗剂西妥昔单抗可以诱导细胞产生自噬，而抑制自噬可以促进西妥昔单抗诱导细胞凋亡的作用。我们前期研究发现：CDK抑制剂P57诱导细胞周期阻滞抑制肝癌细胞增殖。为明确P57调控细胞自噬在肝癌发生发展中的作用及机制及其对HCC细胞对EGFR抑制剂的敏感性的影响，本课题通过构建DEN诱导小鼠肝癌模型，分析癌变过程中P57与肝癌自噬的关系；采用慢病毒转染技术构建P57稳定下调的肝癌细胞系，利用Western Blot、免疫沉淀、免疫荧光染色探讨P57与LIMK1/Cofilin通路之间的关系；利用脂质体转染技术构建p57上调与p57阴性对照组的HCC细胞系，通过MTT法和死活细胞染色法、流式细胞术研究不同细胞系对Er和C-225的敏感性，用Western blot法检测Er和C-225对不同细胞系中细胞自噬相关基因LC3B-Ⅱ、Beclin-1表达的影响，最后，加入自噬抑制剂氯喹(CQ)抑制细胞自噬后，再次检测Er/C-225作用前后细胞增殖抑制率及自噬的改变。我们研究发现：1.DEN诱导肝癌发生过程中，小鼠肝组织内P57表达逐渐降低与自噬相关基因beclin1、LC3表达逐渐升高；2.P57可以调控胞质中LIMK1的活性，从而调节p-cofilin在胞质中的表达水平；3.p57可以通过抑制Er/C-225诱导的HCC胞自噬，增加HCC细胞对Er/C-225的敏感性。本研究为探寻HCC治疗的新靶点提供实验依据和理论基础，具有重要的科学意义和应用价值。