活血化瘀方抗糖尿病心肌纤维化的生物网络调控机制研究

以往中药作用机制的研究多是选择现代医学研究公认的疾病的关键病理环节、通路、分子开展研究，没有从中药本体出发，发现真正反映中药自身特点的作用机制。我们从生物网络的新视角出发，提出中药生物网络调控作用机制研究的假说：中药通过调控生物网络发挥作用，其作用标志物（markers）具有模块性。为验证假说，我们在活血化瘀理论的指导下，以活血化瘀方（双参宁心方）抗糖尿病心肌病的研究为载体，结合该方以往的研究基础（见工作基础），采用链脲霉素致大鼠糖尿病心肌病模型与心肌成纤维细胞培养模型，从心肌纤维化为切入点，采用基因芯片、Western blot等实验技术，通过基因组学-网络分析-信号通路-分子等降维处理方法，研究该方抗心肌纤维化的生物网络调控的作用机制，探索建立中药作用机制研究的新思路与新方法，也为活血化瘀法治疗糖尿病心肌病提供现代生物学依据。

中药的作用机理研究是当今中医药领域面临的重大科学问题，网络药理学的出现，使从生物分子网络的角度研究中药多靶点、多途径的作用机制成为可能。本课题以糖尿病心肌病与活血化瘀方（双参宁心方）为研究对象，采用链脲霉素致大鼠糖尿病心肌病模型与高糖诱导的心肌成纤维细胞增殖分化模型，应用基因芯片、Western blot、生物网络分析等研究技术，从心肌纤维化为切入点，研究了双参宁心方抗糖尿病心肌纤维化的生物网络调控作用机制。动物实验发现，双参宁心方能明显降低糖尿病心肌病大鼠I型胶原吡啶交联终肽（ICTP）与III型前胶原氨基端肽（PIIINP）血清含量，改善心肌组织纤维化程度；能明显提高心功能指标左室压力上升最大速率与最大下降速率；能明显降低大鼠RASS系统ALD、Ang-2、Renin血清含量，以及炎症因子IL-10、IL-17、IL-1β、TNF-α、TGF-β血清含量。基于传统的单基因表达差异分析显示，双参宁心方的作用信号通路主要集中于生命活动中细胞代谢的基本通路，如类固醇的生物合成通路、果糖和甘露糖代谢通路、胰岛素信号通路和TGF-beta 信号通路。基因表达网络中单基因表达连接性差异分析发现，双参宁心方的作用信号通路主要集中于TGF-β、Wnt 信号通路、泛素介导的蛋白降解等分子通路，以及与糖代谢相关、细胞自噬、PPAR 信号通路等。基于网络模块的系统生物学分析发现，双参宁心方的作用主要集中于3个网络模块，其中M1模块较为显著富集的通路为ECM 受体相互作用通路、肥大性心肌病通路、膨胀性心肌病通路等；M2 模块较为显著富集的通路主要是氧化磷酸化、果糖和甘露糖代谢等几个通路；M3 模块较为富集的通路主要是PPAR 信号通路等。体外实验发现，双参宁心方有效成分脱氢紫堇碱、丹酚酸A、人参皂苷Re、人参皂苷Rg1均能抑制高糖培养的心肌成纤维细胞的增殖，降低I型、Ⅲ型胶原分泌；减少TGF-β1的合成；可以明显抑制Wnt信号通路β-catenin的表达，上调P-GSK-3β的表达。上述结果表明，活血化瘀方（双参宁心方）具有明显的抗糖尿病心肌病的作用，且与其有效成分抑制心肌成纤维细胞Wnt信号通路有关，同时也验证了本课题提出的中药生物网络调控作用机制研究的假说：中药通过调控生物网络发挥作用，其作用标志物具有模块性。