不含金属和辅因子的氧化酶和加氧酶催化反应机理的理论研究

Although the majority of oxygen-metabolizing enzymes depend on transition metal ions or organic cofactors for catalysis, a significant number of oxidases and oxygenases neither contain nor require any cofactor. This kind of enzyme plays a vital role in the metabolism of waste in vivo and has attracted more and more attention in the medicinal field. Therefore, the theoretical study on the general catalytic mechanism of the cofactor-free oxidases and oxygenases would not only be helpful for understanding the metabolism processes in vivo, but also provide valuable clues for rational design of the enzyme mutants with high efficiency. However, to the best of our knowledge, the detailed reaction mechanism concerning how the enzymes catalyze the metabolism of different organic compounds has not been understood very well, which is due to the lack of extensive theoretical studies on the complicated enzyme-catalyzed reactions at the molecular level. This prompted the applicant to propose this theoretical project on the basis of our previous work. In this project, we will build the binding models of metal- and cofactor-free oxidases and oxygenases with various types of substrates, and perform the computational studies on these enzyme catalytic reactions using the molecular dynamics simulations and first-principles quantum mechanical/molecular mechanical free energy calculations (QM/MM-FE). We aim to uncover the detailed reaction mechanisms of the cofactor-independent oxidases and oxygenases, explore the correlation between the structures and reactivities of the key residues in the active site, demonstrate the factors that influence energy barrier of the rate-determining step, and thus provide a solid mechanistic base and valuable insights for the researchers in the medicinal field to use in their future rational design of novel, more potent enzyme mutants.

大多数以氧气为氧化剂的代谢酶离不开金属离子和有机辅因子，但也有为数不少的氧化酶和加氧酶催化反应是不需要辅因子参与的。这类酶在生物体内的废物代谢过程中起到了至关重要的作用，并已在医药领域吸引了越来越多的关注。因此，研究此类酶催化机制不仅有助于理解生命中的代谢过程，而且可以为设计高活性酶突变体提供思路。然而据我们所知，关于这类酶催化氧化代谢不同有机物的详细反应机理至今尚不清楚，还缺乏在分子水平上对其进行深入地理论研究。这促使申请者在前期酶反应机理的理论研究工作基础上，首先构建这些酶催化氧化不同有机物的反应模型，然后使用分子动力学模拟和pseudobond QM/MM-FE相结合的方法对酶催化反应进行深入研究，揭示酶催化活性位点的具体氧化反应机理，阐明活性位点中关键残基所起的作用，并探索影响整个反应决速步能垒的因素，从而为人们筛选和合成更高效的能应用于医疗领域的酶突变体提供有价值的理论参考数据。

本项目主要用QM/MM的计算方法对不含辅因子的氧化酶和加氧酶（包括氧化酶、单加氧酶、双加氧酶）催化活化三重态氧气反应的一般作用机制进行了理论研究。不含辅因子氧化酶（尿酸酶）催化活化氧气反应机制：（1）通过一个质子转移伴随一个电子转移（PCET）过程，底物8-hydroxyxythine（8-HX）转化为一个阴离子自由基，这与以前推测的在催化反应过程中通过二价负离子中间体（UA2-）进行电子转移的反应机理有明显的不同；（2）质子转移到O2-负离子自由基；（3）双自由基重新组合经过MECP形成一个单重态过氧化物中间体。该部分工作已经发表在ACS Catalysis杂志上（ACS Catal. 2017, 7, 4623−4636）。不含辅因子双加氧酶（1-H-3-羟基-4-氧代喹那啶-2,4-双加氧酶，HOD）催化活化氧气反应机制：（1）底物1-H-3-羟基-4-氧代喹那啶（QND）的去质子化伴随着底物上的一个单电子转移（PCET）到三重态的氧气形成双自由基；（2）超氧阴离子·OO-自由基与底物自由基经由一个开壳单重态过渡态通过双自由基偶联形成过氧化物中间体；（3）通过闭环过程形成五元双环结构；（4）一氧化碳（CO）解离。整个反应的能垒（14.9 kcal/mol）与实验估算能垒（15.5 kcal/mol）相近。不含辅因子单加氧酶（ActVA-Orf6单加氧酶）催化氧化6-脱氧二氢卡拉芬净（DDHK）的反应机制：（1）氧气在一分子水的帮助下直接抽取底物羟基上的质子，同时伴随着一个电子转移（PCET）得到双自由基•DDHK‒H和•OOH；（2）双自由基重新络合形成C‒O单键；（3）形成的O‒O单键在一分子水帮助下通过六元环过渡态断裂脱去水分子。整个反应的能垒为20.7 kcal/mol，这与实验推算的活化能垒（19.7 kcal/mol）非常接近。受这些反应启发，我们提出了一个中继的质子协同电子转移（Relayed PCET）模型，并把这部分工作发表在了JACS杂志上(J. Am. Chem. Soc. 2022, DOI: 10.1021/jacs.1c12360)。这些反应机制研究不仅对于理解氧气参与的新陈代谢和PCET过程有帮助，而且能为将来合理设计新型突变蛋白酶药物提供有价值的参考。