青藏高原不同动物小肠结肠炎耶尔森氏菌生物学与毒力相关基因特征研究

Since the fundamental research of zoonotic Yersinia enterocolitica in the Tibetan Plateau is few the interspecific transmission, serotype, biotype and distribution of virulence genes of Y. enterocolitica in this region are poorly understood. Based on the systematic survey of Yersinia enterocolitica of 15 kinds of animals and durg sensitive fauna test in the part areas of the Tibetan plateau in recent years, this project plans to culture and isolate zoonotic Y. enterocolitica by using of the low temperature enrichment method investigate the serotype and biotyping of Yersinia enterocolitica by means of LAMP, PFGE and MLST. The virulence gene distribution and drug resistance gene will be subsequemtly detected with PCR method. The deletion mutants in the invasion associated gene ail, inv and yadA are generated by using of the lambda red recombinase method and detect its biological characteristics and the phenotype test. The aims of this project are to explore and clarify the following questions: 1)Does the bacteria occur variation in the complex and diverse natural and climatic conditions of the Tibetan plateau? How about the drug sensitivity genealogy? 2)Are there significant variations on the occurrence, the epidemic and the biological nature(including serotype of strains) between plateau region and inland. 3)How about the distribution of the biological spectrum(including serotype and biotyping) and the major virulence gene of epidemic strains in this region? 4) what are the biological characteritics of deletion mutants and complementation strains? The results would provide foundation for the biological characteristics, the distribution of virulence genes, the molecular pathogenesis of invasion genes and the prevention research of Yersinia enterocolitis in the Tibetan plateau.

因青藏高原人兽共患小肠结肠炎耶尔森氏菌基础研究甚少，致使人们对该菌在此地区种间传播、血清型、生物型及毒力基因分布认识有限。近年来，项目组对部分地区15种动物源小肠结肠炎耶尔森氏菌及其药敏区系进行了系统研究，本研究拟在此基础上，采用低温富集分离，用LAMP、PFGE及MLST法对其进行检测、血清型与生物分型，用PCR法进行毒力基因分布特征和耐药基因检测，用同源重组构建该菌ail、inv、yadA基因缺失与互补株，针对其生物学及分子致病表型实验，探索并阐明以下几个科学问题：1）在高原复杂多样的自然和气候条件下，该菌是否发生变异？其药敏区系谱如何？2）高原地区该病发生、流行及病原生物学特性（血清型、生物型）是否与内地不同？3）该地区流行菌株生物型及主要毒力基因分布情况怎样？4）其缺失、互补株生物学特性如何？研究结果可为高原该菌生物学特性、毒力基因分布特征、侵袭基因分子致病机制及防控研究奠定基础。

本研究针对青藏高原不同地区不同来源样品进行了小肠结肠炎耶尔森氏菌的种间分布、血清型与生物型、药敏区系、主要毒力基因分布特征、侵袭相关基因突变株与回补株构建及其生物学特性分析，初步摸清了该菌在青藏高原不同地区的携带率、血清型与生物型、耐药谱及毒力基因分布情况，为后期深入开展青藏高原小肠结肠炎耶尔森氏菌的传播机制及溯源研究积累了流行病学资料。通过对来源于青藏高原10个地区53种动物和牧民食品的3677份样品进行常规病原分离及DPO检测，共获得了275株小肠结肠炎耶尔森氏菌株，同时建立了LAMP方法并对部分菌株进行了临床检测。种间分布结果显示，38种动物携带该菌，冬季分离率高于春季的分离率，其中放牧动物携带率大多低于舍饲动物或圈养野生动物，人源小肠结肠炎耶尔森氏菌的分离率最低；其余15种动物未检出该菌。随机选取部分菌株进行血清型和生物型检测，结果显示，大多菌株为O:9血清型和1B生物型。耐药谱检测结果显示，选取的56株不同动物源分离株对β-内酰胺类等5类抗生素均检出了相关耐药基因，且存在双重或多重耐药现象。通过对不同动物源小肠结肠炎耶尔森氏菌的5种主要毒力基因的检测，结果显示，致病性菌株的毒力基因分布特征为ail+、ystA+、ystB-、yadA+、vir F+；非致病性菌株的毒力基因分布特征为ail-、ystA-、ystB+、yadA-、virF-。成功完成牦牛源分离株主要毒力基因的克隆及序列分析，并对ail、yadA、virF、yst基因进行原核表达，未诱导菌在对应位置无明显的蛋白表达条带，与预测理论值相符。将牦牛源ZDN6菌株经全基因组测序后，成功构建了ail和inv基因突变株和回补株，并对其相关的生物学特性进行了检测。研究结果揭示了青藏高原不同地区不同动物源小肠结肠炎耶尔森氏菌的生物学特性、种间分布、药敏区系谱、毒力基因分布特征及其分子进化关系，为后期深入开展该菌侵袭基因分子致病机制及防控研究提供技术支撑。