用斑马鱼和小鼠研究核仁基因nom1突变后造成胰腺发育缺陷的作用机制

In a genetic screening, a pancreas mutant dc5 was identified. In dc5 mutant, the endocrine pancreas increases to about two folds of wild type group, and the exocrine pancreas reduces to about 1/6 of wild type group.The mutated gene, nom1, was cloned by positional cloning approach.In situ hybridization with nom1 antisense RNA probe showed that nom1 is ubquintiously expressed in embryo and it's a maternal gene. Up to date, there are only 3 published papers of nom1 functional study. Nom1 was first cloned in human in 2005. In cultured cell, nom1 is localized in nucleolus and has physical interactions with eIF4A1, eIF4A2, eIF4A3 and PP1γ. In HEK293T cell, knockdown of nom1 by siRNA caused decrease of the formation rate of 18S rRNA. These findings can not link nom1 to pancreas development. Therefore, we plan to investigate the role of nom1 in pancreas development, and answer two main questions: 1. which genes does nom1 interact with to regulate the development of pancreas? 2. As a ubiquitiously expressed housekeeping gene, how does nom1 seletively regulate pancreas, but not cause severe overall defect? Two more cases of housekeeping gene regulating a certain kind of cell were reported previously, RPS19 regulates erythropoiesis and seryl-tRNA synthetase regulates angiogenesis. So we speculate that there might be some unknown mechanisms behind these cases.

申请人在前期工作中筛选到了一个斑马鱼胰腺发育缺陷突变体dc5，其胰腺内分泌腺增大，约为野生型的2倍，外分泌腺减小，约为野生型的1/6。用定位克隆方法找到了突变的基因是nom1。初步的表达谱分析显示nom1是母源基因，在斑马鱼胚胎中泛表达。Nom1于2005年在人中首先被克隆，至今只有3篇功能研究的文章。已知nom1定位于核仁区，跟eIF4A1、eIF4A2、eIF4A3和PP1γ等有直接的物理接触。在HEK293T细胞中用siRNA敲低nom1造成18S rRNA产率下降。这些研究结果不能把nom1跟胰腺发育联系起来，因此申请人计划研究nom1功能缺失后造成胰腺发育缺陷的作用机理，回答下面的问题：1. nom1是通过跟哪些基因相互作用来调控胰腺发育，怎样整合到已知的调控网络中？2.nom1作为泛表达的持家基因，通过什么方式来特异性地影响胰腺发育？而对其它的器官没有显著影响？

Nom1于2005年在人中首先被克隆，至今只有3篇在细胞中进行功能研究的文章。已知 nom1定位于核仁区，跟 eIF4A1、eIF4A2、eIF4A3 和 PP1γ等有直接的物理接触，但是这些基因都没有报道跟胰腺发育有关。申请人观察到斑马鱼nom1突变体的胰腺外分泌部显著的变小，约为野生型的1/6，因此提出研究nom1突变后造成胰腺发育缺陷的作用机制：nom1是通过跟哪些基因相互作用，通过哪些信号通路成为胰腺发育的必要基因的。我们仔细检查了nom1突变体的表型，结果显示细胞水平上主要是ptf1a阳性的胰腺前体细胞增殖受阻造成了胰腺显著变小，分子水平上nom1突变体的核糖体生成和mRNA前体的剪接都受阻，此功能跟nom1蛋白的定位于核仁区一致。某些核糖体生成跟p53基因有关，我们的结果显示nom1缺失造成的核糖体生成缺陷跟p53基因无关，暗示通过未知的基因/信号通路影响了胰腺发育。RNA-Seq结果显示Dla，fgf8，fabp10a等直接调控内胚层器官/胰腺发育的基因的表达量降低和剪接体异常。RNA-Seq分析提供了受到nom1调控的候选基因，其中Pp1a（protein phosphatase 1 alpha）可以部分拯救nom1突变体的胰腺缺陷表型。此部分结果已经发表在Plos One上（Nom1 Mediates Pancreas Development by RegulatingRibosome Biogenesis in Zebrafish）,他引已有6次，其中包括至少两篇核糖体生成功能研究领域的权威综述，可见受到了认可。申请人在研究Nom1的作用机制的过程中也逐渐意识到核仁和核糖体生成会具有器官水平上的选择性的调控功能。核糖体生成（ribosome biogenesis）是细胞生物学的基本事件之一，曾经人们认为核糖体生成是细胞的一项持家功能（housekeeping function），通常不会产生特异性的作用。但是近年来逐渐有报道指出核糖体生成过程存在着选择性的调控，参与干细胞分化，个体发育，组织稳态维持，和癌症。Dead box RNA helicase 是一大类跟核糖体生成，mRNA剪接，mRNA运输有关的基因。申报人在斑马鱼中敲除Dead box RNA helicase 基因dhx33后，观察到会抑制核糖体生成，进而造成肝脏和胰腺显著减小。虽然