抗体Fc段抗聚集性的优化

Therapeutic antibodies continue to represent the leading group of biopharmaceutical products. Unfortunately, many of them tend to aggregate during expression, purification,formulation and storage etc., which significantly constrains the use of them for clinic purpose. Therefore, decrease of aggregation in antibodies is one of the important tasks in the related field. In this proposal, we are firstly going to use computer to predict the aggregation prone regions (APRs) on antibody Fc fragment CH2 domain. Then phage display library (size is more than 10 to 10) will be constructed by random mutagenesis on these regions. This library will be panned against antibodies which recognize conformational epitopes on CH2 under press conditions (e.g., relatively high temperature, presence of urea). An Fc mutant library will be obtained after panning. Low frequency mutations will be performed on the obtained Fc mutant library and the mutants will be displayed on yeast cell surface for construction of a yeast display library (size is between 10 to 8 and 10 to 9). This library will be panned again against Fc receptor such as neonatal Fc receptor (FcRn) and the anti-CH2 conformation antibodies as described above. The Fc mutants with improved aggregation resistance and maintained (or enhanced) FcRn binding will be identified. This work will be helpful for solving the aggregation problem of therapeutic antibodies, and developing other protein drugs.

研发治疗性抗体是当前制药领域的热点之一。然而很多抗体在其表达、纯化、制剂及贮存等过程中，会倾向于聚集，极大地限制了其临床运用。因此，减少抗体的聚集性是该领域亟待解决的问题之一。本申请通过计算机分析，确定抗体Fc段上CH2域内易于聚集的位点，对这些位点进行随机突变，构建噬菌体展示库（库容大于10的10次方）。以识别CH2构象的抗体为靶标在压力条件（如较高温度，尿素存在）下进行筛选，得到抗聚集的Fc突变库。再对该Fc突变库进行低频随机突变，构建酵母展示库（库容在10的8次方到9次方）。以Fc受体比如新生Fc受体（FcRn）、识别CH2构象的抗体为靶标再次进行筛选，对得到的突变体进行理化分析，从而得到抗聚集并保持或增强与FcRn结合活性的Fc突变体。本研究尝试通过构库这一高通量筛选方法提高Fc抗聚集性能力，有助于解决治疗性抗体的聚集问题，也为其它蛋白质类药物的研发提供借鉴。

研发治疗性抗体是当前生物制药领域的热点。然而很多抗体在其表达、纯化、制剂及贮存等过程中，会倾向于聚集，极大限制了其临床运用。因此，减少抗体的聚集性是该领域亟待解决的问题。本课题围绕提高抗体Fc片段的抗聚集性开展。.我们通过对抗体Fc片段CH2结构域进行晶体结构分析，结合已有研究工作，设计了Fc的截短突变体Fcs，并对其进行了表达纯化。通过分子筛色谱发现Fc和Fcs在PBS溶液中均以天然形式存在。之后，利用圆二色谱（circular dichroism，CD）比较了Fc和Fcs的二级结构。Fcs在25°C仍然保持典型的β-折叠结构，与Fc的结构相似。继续用CD测定它们的热变性，发现在Fcs中，CH2结构域的熔解温度（Tm）为70.0°C，比Fc中CH2的Tm（66.0°C）高4°C，而Fcs和Fc中CH3结构域的Tm值相似。进一步利用差示扫描量热（differential scanning calorimetry，DSC）来测量热变性，得到的结果与CD结果一致。在尿素诱导的解折叠中，引起Fcs中CH2变性的尿素中点浓度比Fc中的高约1.0 M，对CH3来说仍然一致。这些结果表明Fcs比Fc更稳定。然后，我们比较了Fc和Fcs的抗聚集性。在60°C孵育下，Fcs中聚集的形成（浊度）比Fc中聚集的形成慢。化学交联实验表明在60°C孵育后，Fc中寡聚体产物更多，而在Fcs蛋白中形成非常少的寡聚体。这些结果表明Fcs比Fc更抗聚集。在血清孵育实验中，我们发现相比Fc，Fcs在血清中更稳定，提示在体内Fcs具有更长的血浆半衰期。.为了评价Fcs的应用价值，我们替换了临床上治疗类风湿性关节炎药物依那西普（T-Fc）中的Fc片段，得到改造的依那西普（T-Fcs）。实验结果表明T-Fcs和T-Fc一样，可以有效结合药物靶点TNF-α。我们进一步通过Biacore测量T-Fcs与人新生Fc受体（human neonatal Fc receptor，hFcRn）的结合能力，测得T-Fcs对hFcRn结合能力和人IgG1的Fc片段以及T-Fc相似。以上结果表明，Fcs可用于对基于Fc的药物（包括治疗性单克隆抗体和Fc融合蛋白）的改造中。.通过该课题的研究，我们得到了稳定性和抗聚集性增强的Fc截短突变体Fcs，可用于改造基于Fc的药物，具有非常重要的意义和良好的应用前景。