靶向间皮素的新型C-型单域抗体筛选及其抗肿瘤作用机制研究

The market of engineered antibodies for treatment of cancer remains one of the fastest-growing segments in the pharmaceutical industry. Mesothelin is a tumor differentiation antigen that is highly expressed in mesothelioma and many adenocarcinomas. It is involved in tumor proliferation, invasion, anti-apoptosis and drug-resistance and becomes a hot target for development of anti-tumor antibodies. All the currently reported antibodies mainly inhibit tumor through immunotoxin conjugation, ADCC and CDC. In contrast, they can not directly inhibition tumor cell proliferation or induce their apoptosis. Reduction of the size of full-length monoclonal antibodies (e.g., technique of antibody variable domain-based single domain antibodies) is one of the important directions of next generation antibody drugs. C-based single domain antibodies (C-sdAbs) are novel single domain antibodies based on antibody constant CH2 domain. In this proposal, we are going to select C-sdAbs interfering mesothelin-meditated single pathway with potential for clinic use. We will estimate their anti-tumor activities in cell level and animal model, and elucidate the mechanisms for inhibition of proliferation and induction of apoptosis, etc. The physicochemical properties and safety of these C-sdAbs will be evaluated while the key amino acids involved in antibody-antigen interaction will also be analyzed. We expect to obtain candidates with potential for treatment of cancer. With performance of the project, we want to further optimize and develop C-sdAb technique and push them into the clinic use of treatment of cancer and other diseases.

针对肿瘤的基因工程抗体是当前药物研发的重要方向。间皮素是一种肿瘤分化抗原，在间皮瘤及多种腺癌中高表达，与肿瘤的增殖、浸润、抗凋亡性及耐药性密切相关，近年来成为药物研究的热门靶标。在研针对间皮素的抗体多数通过偶联免疫毒素、ADCC和CDC而起作用，并不能直接抑制肿瘤细胞的增殖或者诱导其凋亡。抗体小型化（比如基于抗体重链可变区的V-型单域抗体技术）是下一代抗体药物的重要发展方向。基于抗体恒定区的CH2结构域骨架的C-型单域抗体是一种新型的单域抗体。本申请中，我们将筛选干涉间皮素信号通路的具有临床应用潜在价值的新型C-型单域抗体，在细胞水平和动物模型上验证其抗肿瘤活性，从抑制增殖、诱导凋亡等角度阐释其作用机制，从理化性质和安全性角度进行评价，解析抗原和抗体相互作用的关键氨基酸，为治疗间皮素相关肿瘤提供新的候选药物。通过项目的实施，完善并发展C-型单域抗体技术，推动其在癌症等疾病治疗上的应用。

间皮素（mesothelin, MSLN）是一种肿瘤分化抗原，在正常组织中有限表达，在某些癌症中高表达：如间皮瘤、胰腺癌、上皮性卵巢腺癌等。MSLN在肿瘤细胞的增殖、粘附、浸润等方面可能起着重要的作用。目前，针对间皮素的免疫治疗研究方向主要包括抗体药物（包括抗体偶联药物）、嵌合抗原受体 T 细胞免疫疗法以及疫苗。筛选靶向MSLN介导的肿瘤细胞信号通路的候选抗体，可以为治疗间皮素相关肿瘤提供新的候选药物，有助于更好地理解MSLN在肿瘤发生中的作用机制以及进一步验证靶点的有效性。我们表达了MSLN-Fc及截断的D1-Fc、D2-Fc、D3-Fc融合抗原，通过细胞功能实验初步证明MSLN的主要功能区域在D1，并利用MSLN-Fc和D1-Fc进行C-型单域抗体的筛选，得到多株候选克隆，亲和力在亚nM至nM级别，其中1株候选克隆F1具有体外和体内抑制肿瘤细胞增殖的活性。为了进一步研究MSLN促进肿瘤的机制，我们用MSLN-Fc免疫小鼠。免疫后的小鼠血清能够特异性结合到MSLN阳性细胞上，阻挡MSLN与受体细胞的结合。后续分选小鼠B细胞，构建小鼠Fab噬菌体展示文库。经过筛选，得到W1、F11等多个鼠源全长单克隆抗体。其中W1能特异性结合到细胞表面的MSLN，阻挡MSLN与受体细胞的结合，初步证明W1在抑制MSLN介导的细胞迁移中有作用。我们还确定了W1结合的关键位点位于MSLN的D1结构域的N-端。除此之外，我们构建了MSLN敲除细胞系；从分子水平证明了MLSN能够促进下游信号通路分子p38磷酸化和基质金属蛋白酶7（MMP7）的表达，表明其在促进肿瘤中的作用；建立了可视化的小鼠卵巢腺癌肿瘤模型。这些工作为后续评估抗体在抑制肿瘤转移中的作用奠定了基础。总的来说，我们的工作不仅为靶向间皮素的肿瘤治疗提供了新的候选C-型单域抗体，也有助于深入理解间皮素促进肿瘤的机制，为研发针对MSLN的靶向药物提供支撑。