人ESC源性起搏细胞纯化、鉴定及功能研究

通过人ESCs源性起搏细胞移植重建生物起搏是目前治疗病态窦房结综合征（SSS）最理想的方法之一。我们研究发现体外诱导分化的人ESCs源性搏动心肌细胞团，并证实其中存在起搏细胞。如何获得高纯度的人ESCs源性起搏细胞是突破目前干细胞应用于临床治疗SSS "瓶颈"的重要环节。晚近研究发现起搏细胞来源于Tbx3阳性心脏祖细胞。我们实验已证实在人ESCs向搏动心肌细胞团诱导分化过程中出现了Tbx3基因表达。据此，我们率先提出采用细胞捕捉法，纯化人ESCs源性起搏细胞的新思路：将人转录因子Tbx3基因启动子与GFP基因融合,转染入人ESCs，当其分化为Tbx3阳性搏动心肌细胞时，Tbx3基因启动子启动GFP基因的表达，利用GFP标记捕获Tbx3阳性细胞；通过分子生物学和细胞电生理鉴定其是否为起搏细胞；并移植到猪SSS模型上，进一步在体内评价移植细胞生物起搏的功能，为用于临床治疗提供更充分的科学依据。

通过人ESCs源性起搏细胞移植重建生物起搏是目前治疗病态窦房结综合征（SSS）最理想的方法之一。如何获得高纯度的ESCs源性起搏细胞是突破目前干细胞应用于临床治疗SSS “瓶颈”的重要环节。我们首先展开了关于如何定向诱导ESCs向心肌细胞分化，并提高ESCs向起搏细胞分化的效率问题研究。通过多次实验发现：1）形成EBs的起始ESCs数量；2）EBs贴壁的时间，是影响ESCs向心肌细胞分化至关重要的两个因素。我们的研究结果显示形成EBs的起始ESCs数量越多，向心肌细胞分化程度越高，其中我们实验结果发现1000个/EB最优。另外EBs在分化第4天或者更早的时间贴壁，ESCs向心肌细胞分化将被显著抑制。同时发现在mESCs向心脏分化过程中ET-1发挥重要的作用，特别是传导系统分化；并且ERK1/2通路参与ET-1的这个作用。联合应用促分化剂VitC可以进一步提高分化后起搏细胞的比例。如何选择起搏细胞的基因标记将其中的起搏细胞进行纯化是研究的难点。本研究在孕12周流产胎儿右心房上部SHOX2基因表达高于其它部位，并特异性表达在传导系统，以SHOX2基因作为起搏细胞的标记基因；将转录因子SHOX2基因启动子与GFP基因融合,转染入ESCs，当其分化为SHOX2阳性搏动心肌细胞时，SHOX2基因启动子启动GFP基因的表达，利用GFP标记捕获SHOX2阳性细胞；并通过分子生学和细胞电生理鉴定其为起搏细胞。