抗前列腺癌单链抗体介导的靶向siRNA抑制NOTCH-1基因抗肿瘤的实验研究

我们的前期研究工作显示Notch信号通路中的Notch-1在前列腺癌的发生发展中起重要作用，应用siRNA抑制前列腺癌细胞中Notch-1表达可引起细胞周期阻滞，有效抑制肿瘤细胞生长，因此应用siRNA抑制Notch-1有望成为一种有效的前列腺癌基因治疗手段。但由于缺乏有效地靶向给药系统限制了此技术的进一步应用。本课题在已成功获得高亲和力特异性抗前列腺癌单链抗体ScFvE4B7基础上，拟将其与具有核酸结合功能的人鱼精蛋白片段融合，构建成单链抗体介导的靶向输送系统并予以优化；siRNA与该系统结合后，在抗体的引导下到达靶细胞，随抗体内化入细胞，从而高效抑制Notch-1表达。利用抗体引导，siRNA可以特异性地到达肿瘤部位，从而实现特异、高效的抗肿瘤作用，同时避免siRNA大量应用时所产生的"脱靶"效应，此策略将为RNAi技术在肿瘤研究、治疗中的应用开辟新途径。

通过siRNA下调Notch1基因可以显著抑制人类前列腺癌细胞的生长。然而,如何靶向输送siRNA进入特定细胞是临床应用此技术关键障碍。最近的报告表明,单链抗体介导.的靶向输送系统是一靶向下调相应基因的有效方法。为了解决RNA干扰技术体内应用缺乏靶向性的难题，我们拟构建抗前列腺癌单链抗体的融合基因，进行表达和纯化后获得scFv\Fdt\HA2\tP融合蛋白，构建成siRNA靶向输送系统，并予以优化，利用FITC-siRNA在体内外验证这一系统的有效性；随后验证靶向输送的针对Notch-1抑制效果最佳的siRNA在体内外对前列腺癌细胞生长的抑制作用。利用这一系统将不但能够克服siRNA体内输送效率低下的问题，还将避免siRNA大量应用时所产生的“脱靶”效应和非特异性免疫反应，实现对肿瘤生长的高效抑制，为RNA干扰技术在前列腺癌的临床治疗中的应用提供理论和实验依据。前列腺特异性膜抗原（PSMA）目前被认为是一个较明确的前列腺抗原。本研究的目的是评估单链抗体及两种融合蛋白是否可以有效将特定的siRNA输送到PSMA阳性的前列腺癌细胞内。融合蛋白一个由PSMA单链抗体(s)和截断鱼精蛋白(tP)。将弗林蛋白酶(furin)、流感病毒的融合肽(HA2)片段序列插入到单链抗体及截断鱼精蛋白之间构成另一融合蛋白。我们的结果表明, siRNA能够被融合蛋白特异性的输送到PSMA阳性的前列腺癌细胞内，sFH-tP融合蛋白效果更明显。应用前列腺癌细胞系及前列腺癌裸鼠荷瘤模型，验证靶向输送系统引导下，siRNA是否能够在体内实现对Notch-1的高效抑制，实现高效的抗肿瘤效果。进一步的研究证实了siNotch1融合蛋白可以在体内及体外有效地抑制前列腺癌细胞的增殖。本研究成果将开创一种具有我国自主知识产权的、高效、特异、安全可行的治疗前列腺癌新疗法，具有重大的临床意义与广阔的应用前景。 文章：1.Targeted knockdown of Notch1 in PSMA-positive human prostate cancer cells by single-chain antibody mediated small interfering RNA delivery。2.Repression of NR4A1 by a chromatin modRepression of NR4A1 b