养殖场废弃物中残留的抗生素对堆肥过程微生物群落和抗性基因的影响

Antibiotics and antibiotic resistance genes (ARGs) are frequently detected in livestock waste. It has become a great concern for public health that ARGs may transport to pathogens by lateral gene transfer. This study focuses on the effect of antibiotics on microbial communities and ARGs during thermophilic composting. Static aerobic composting are conducted using dairy manure from dairy feed with oxytetracycline, enrofloxacin and sulfamethoxazole respectively, and a control is also established with dairy manure without using antibiotics. Samples are collected at various stage of composting, and antibiotic level, microbial community diversity and ARGs are determined by HPLC-MS, 16S rRNA gene high-throughput sequencing and RT-qPCR respectively. The effect of operation condition on abundance of ARGs is investigated to find out main influence factors causing variation of ARGs. The relationships among ARGs, antibiotics and microbial community are analyzed to clarify the influencing mechanism of dynamics in ARGs during aerobic composting. The associations among antibiotics, microbial community and enzyme activities are studied to understand the effect of antibiotics on process of mineralization and humification during aerobic composting. The results of this study could reveal the influencing mechanism of antibiotics on ARGs and aerobic composting process, thus provide theoretical basis for taking effective measures to reduce antibiotics and ARGs level, and improving the harmless treatment and resource utilization of livestock waste.

养殖场废弃物中残留大量的抗生素和抗生素抗性基因（ARGs），ARGs可通过基因水平转移到致病菌中，威胁人类健康。本项目重点研究养殖场废弃物残留抗生素对堆肥过程中微生物群落和ARGs的影响。分别以添加土霉素、恩诺沙星、磺胺甲噁唑的饲料饲养奶牛，以不含抗生素的饲料饲养奶牛为对照，采集奶牛粪便，对其进行静态高温堆肥。利用HPLC-MS测定抗生素浓度的变化；利用16S rRNA gene高通量测序技术，测定微生物群落多样性的变化；利用RT-qPCR，测定ARGs丰度的变化。研究堆肥参数对ARGs丰度的影响，查明影响ARGs丰度变化的主要影响因子；分析ARGs丰度变化与抗生素和微生物群落的关系，阐明抗生素对ARGs丰度变化的影响机制；分析抗生素与微生物群落、酶活性和ARGs丰度变化的关系，揭示抗生素对堆肥进程和ARGs丰度的影响机理，为养殖场废弃物无害化和资源化利用提供理论依据。

畜禽粪便成为抗生素和抗生素抗性基因（antibiotic resistance genes, ARGs）的主要储存库。本项目研究不同养殖场（鸡场，牛场和猪场）废弃物中 ARGs 和 MGEs（ mobile genetic elements, MGEs）的分布情况，残留泰乐菌素对畜禽粪便好氧堆肥中微生物群落和 ARGs 的影响，以及温度和不同添加剂（煤气化渣和纳米零价铁）对畜禽粪便好氧堆肥过程中 ARGs 和 MEGs 削减的影响。利用Biolog 微平板法和 16S rRNA 高通量测序研究堆肥过程中微生物群落的变化，利用实时定量 PCR 的方法研究抗生素抗性基因的基因丰度的变化。结果发现不同动物粪便中的 ARGs 有显著区别，整体上表现为鸡粪和猪粪中的 ARGs 比牛粪更丰富。利用 Network 分析和回归分析，找出了可能存在于相同的 DNA 片段或者宿主菌中的ARGs，建立了利用指示基因预测畜禽粪便和堆肥样品中ARGs 总丰度的方法。好氧堆肥对不同种类畜禽粪便中的 ARGs 影响不同，对鸡粪和猪粪中的 ARGs 均表现为削减作用，且对鸡粪中 ARGs 的削减效果更好。好氧堆肥轻微降低了肉牛粪中的 ARGs，但提高了奶牛粪中的 ARGs 丰度。冗余分析表明，转座子丰度、重金属 Cu 浓度和全氮含量差异是造成 3 种动物粪便及其堆肥产物中 ARGs 多样性和丰度差异的主要原因。添加泰乐菌素能会抑制堆肥初期微生物活性随后抑制用作逐渐消失且中浓度泰乐菌素能促进 ARGs 和整合子的去除。充分的高温（普通高温堆肥和连续高温堆肥）显著降低了 5/10 ARGs 和2 类整合子。更高的温度、更长的时间会减少 ARGs 的宿主菌（其中包括部分人类致病菌）多样性和丰度，抑制水平基因转移过程，从而降低堆肥产物中的 ARGs绝对丰度。 10%煤气化渣对堆肥中 ARGs 和 MGEs 的削减效果最好。100mg·kg-1纳米零价铁对 ARGs 和 MGEs 的削减效果更好，有效的降低了 9 个 ARGs 和 4 个MGEs 的丰度。细菌群落和 MGEs 是引起堆肥中 ARGs 丰度变化的主要原因。本项目研究了不同类型的养殖场废弃物、堆肥参数以及不同类型的添加剂对 ARGs 和MEGs 的影响，从分子生物学的角度探究了削减好氧堆肥中 ARGs 的丰度的机制，为今后制备含低抗生素抗性基