微小RNA在神经干细胞分化中的调控

微小RNA与神经发育和神经肿瘤的发生密切相关，现已发现神经组织特有的miR-124调控神经分化。我们用基因芯片筛查到一些在神经细胞高表达miRNAs，用northern blot和RT-PCR验证了这些miRNAs确实是在神经细胞高表达，我们前期的实验结果得出：miR-208b，-325*在神经细胞差异表达，miR-208b、-325*分别于c-myc的5'-UTR、CDS结合，抑制c-myc的表达，促进神经分化；离体的实验我们证实miR-208b、-325*的功能，在体研究证实它们的促神经分化的作用，并提示该研究信息对临床干细胞应用有极大价值。为此，我们将在成年脑在体神经干细胞上验证miR-208b、-325*的功能，我们将用基因过表达和基因沉默的技术在体分析miR-208b、-325*对神经干细胞分化的调控，研究结果将有助于对神经分化调控的认识。本项研究具有新颖性、独创性和应用性。

小鼠胚胎干细胞定向诱导分化成神经细胞, 用sox1-GFP, tuj1蛋白鉴定了神经干细胞细胞和神经前体细胞, 用FASC方法分选细胞, 抽提RNA做基因芯片。基因芯片的结果表明： mir-208b和 mir-325*在神经前体细胞和神经元表达上调提示mir-208b和 mir-325*在神经分化中的差异表达可能参与了胚胎干细胞向神经细胞分化的调控。为此用RT-PCR和northern blot方法验证miRNA芯片结果.运用RNA22、RNAhybrid软件预测到mir208b，mir325*可能通过靶基因cmyc调控神经干细胞分化。胚胎干细胞过表达mir325*，mir208b，靶基因cmyc蛋白受到抑制，用荧光素酶双报告基因系统，将mir325*，mir208b与 靶基因cmyc结合的靶mRNA序列与荧光素酶报告基因载体连接，载体构建好以后，与mir325*，mir208b共转染hela细胞48小时，荧光酶发光少，这说明mir325*，mir208b的种子序列与cmc mRNA不完全结合调控cmyc的翻译。综上所述，mir208b，mir325*通过对靶基因CMYC的抑制，抑制了胚胎干细胞的增殖并促进了胚胎干细胞往神经细胞分化。原位杂交实验发现：mir208b，mir325*， CMYC基因在小鼠大脑皮质，海马，以及室管膜下区表达，而这些区域存在神经干细胞，这些实验结果为mir208b，mir325*抑制靶基因 CMYC从而调控小鼠大脑成体神经干细胞增殖和分化提供逻辑性和合理性，我们合成慢病毒并注射mir208b，mir325*到第三侧脑室，成功地让mir208b，mir325*在室管膜下区过表达，mir325*，mir208b过表达后，SVZ区域神经干细胞表面标志物tuj1增多。可见mir208b，mir325*使得SVZ神经干细胞增殖增加。也增强神经干细胞的分化，使小鼠SVZ区域神经细胞增多，并且增殖的神经干细胞沿着吻侧迁移流到达嗅球分化成神经细胞。