副溶血弧菌VI型分泌系统介导巨噬细胞自噬的靶蛋白的研究

Vibrio parahaemolyticus is an important foodbrone pathogen, which causes acute gastroenteritis in humans through secreting virulent factors. Type VI secretion system 2 (T6SS2) of Vibrio parahaemolyticus is a new secretion found recently, which secretes effectors into the target host cell.It's active in vitro. In our previous study, we found that T6SS2 induced autophagy of macrophagy RAW264.7, providing nutrition during bacterial infection. However，which effector of type VI secretion induces autophagy in RAW264.7? And where does the autophagy happen,inside host cell or out of host cell? Thus, here we attemped to find the effector which induces autophagy based on homologous recombination, two-dimensional electrophoresis, mass spectrum. Then the effector is expressed in macrophagy and added in the medium of macrophagy to find the infection phase of autophagy induced by bacteria which can not invade host cell. This will shed light on novel roles of T6SS2 in Vibrio parahaemolyticus, and be important for further study of autophagy mechanism in Vibrio parahaemolyticus.

副溶血弧菌是一种重要的食源性病原菌，通过分泌多种毒力因子引起人的急性肠胃炎，影响食品和公共卫生安全，威胁人类健康。副溶血弧菌的VI 型分泌系统2（T6SS2）是近年来新发现的一种毒力因子，借由输出效应蛋白实现其生物学功能，在体外处于活化状态。前期研究发现，T6SS2促进副溶血弧菌对巨噬细胞RAW264.7的自噬，为细菌感染过程提供充足的营养。但是T6SS对细胞自噬的靶蛋白，目前尚未知。本项目以副溶血弧菌三缺失株DTTT为模式菌，通过基因敲除、双向电泳和质谱技术寻找T6SS的效应蛋白，分析效应蛋白缺失株对巨噬细胞自噬，确定T6SS2促进细胞自噬的靶蛋白。通过细胞内表达和细胞外添加靶蛋白，研究靶蛋白介导的细胞自噬发生的靶蛋白进入宿主细胞的阶段。本研究对探索副溶血弧菌新的毒力相关因子功能具有重要意义，为进一步探明副溶血弧菌T6SS2靶蛋白自噬机制奠定了基础。

副溶血弧菌是一种重要的食源性病原菌，通过分泌多种毒力因子引起人的急性肠胃炎，影响食品和公共卫生安全，威胁人类健康。副溶血弧菌的VI 型分泌系统（T6SS）是近年来新发现的一种毒力因子，借由输出效应蛋白实现其生物学功能，在体外处于活化状态。前期研究发现，副溶血弧菌中存在两套VI型分泌系统，分别是VI型分泌系统1（T6SS1）和VI型分泌系统2（T6SS2）。T6SS1和T6SS2都贡献了副溶血弧菌对小肠上皮细胞Caco-2和/或真核细胞HeLa的黏附能力。但目前不清楚T6SS1或T6SS2是否能够引起细胞的应激反应。为了研究T6SS1或T6SS2是否贡献副溶血弧菌对细胞的应激反应，比如说细胞毒性或者自噬，本项目以副溶血弧菌三缺失株DTTT为模式菌，通过基因敲除获得T6SS1基因缺失株DTTT-△icmF1和T6SS2基因缺失株DTTT-△icmF2。LDH实验发现，无论DTTT-△icmF1还是DTTT-△icmF2对细胞的毒性都不显著降低，说明两套T6SS都不贡献副溶血弧菌对细胞的毒性作用。自噬实验发现只有缺失株DTTT-△icmF2在感染4h后，对巨噬细胞的自噬作用显著低于亲本株dTTT，说明T6SS2可能介导了副溶血弧菌对巨噬细胞的自噬作用。双向电泳和质谱技术找到了T6SS的可能的13个效应蛋白，发现转位Hcp2和VgrG2可能参与自噬。缺失hcp2和vgrG2基因后，副溶血弧菌对巨噬细胞的自噬作用均下降；但是在细胞内表达Hcp2和VgrG2蛋白后，发现只有VgrG2蛋白使细胞的自噬作用增加了，说明VgrG2蛋白是T6SS2介导副溶血弧菌对巨噬细胞自噬的效应蛋白。分析效应蛋白缺失株对巨噬细胞自噬，确定T6SS2促进细胞自噬的靶蛋白。用氯喹处理后，DTTT-△vgrG2感染后的细胞中的LC3-II显著上升，表明VgrG2能够提高自噬通量；此外，DTTT-△vgrG2能够显著降低细胞外cAMP的含量，说明VgrG2可能参与了cAMP通路来引起细胞的应激。综上，VgrG2是副溶血弧菌T6SS2介导巨噬细胞自噬的效应蛋白，它能够提高自噬通量，并可能通过cAMP信号通路引起细胞的应激反应。