依赖ceRNA调控新思路探索新型佐剂硫酸乙酰肝素的作用机理

The traditional vaccine adjuvant research is mainly based on the trial and error method, and the mechanisms underlying the immune system stimulation remaining largely unknown. To date, alum is by far the most widely used vaccine adjuvant, even though its mechanisms of action remain a mystery. We previously demonstrated that heparin sulfate (HS), a TLR-4 ligand and endogenous danger signal, effectively enhanced humoral and cellular immune responses in mice immunized by HBsAg, and stimulated the DCs phenotypic maturation, but the mechanism is unclear.. In 2011, professor Pandolfi and his colleagues of the Harvard University School of medicine presented a hypothesis about the competing endogenous RNA. Based on this hypothesis ,we propose to analyse the microRNAs expression profiling by deep sequencing technology and the long noncoding RNA expression profiling by microarray of DCs stimulated by HS after 0h, 12h, 24h and 48h. Based on our mRNA expression profile data in previous experiment, we will construct a ceRNA regulation network, and find out the pairs of lncRNA/mRNA, lncRNA/miRNA, and mRNA/miRNA, which have the relationship of ceRNA regulatory .Then, we will further validate that they were actually have the regulation relationship by experiments of cell biology. .The study intends to explore the mechanisms of vaccine adjuvants through the ceRNA and regulation, and to provide a new theoretical foundation for the development of new vaccine adjuvants and the mechanism underlying the stimulation of the immune system.

传统疫苗佐剂研究主要基于试错法，缺乏明确的理论依据。铝佐剂已应用了有一个世纪之久，但是其作用机制并不明确。我们研究发现，内源性危险信号硫酸乙酰肝素可有效增强小鼠体液及细胞免疫应答，具有很好的佐剂效应，但其具体的作用机制尚不清楚。.2011年，美国哈佛大学医学院Pandolfi 教授领导的研究小组提出了竞争性内源RNA 假说。本课题组在此假说的基础上拟对硫酸乙酰肝素刺激DCs之后0h、12h、24h及48h miRNAs进行深度测序，并对其长链非编码RNA进行芯片检测，结合我们前期的mRNA表达谱数据，经生物信息学方法构建ceRNA调控网络，通过分析找出呈ceRNA调控关系的lncRNA/mRNA lncRNA/miRNA及mRNA/miRNA对，再进一步通过细胞生物学实验技术证实该调控关系的存在，从ceRNA这样一个全新的视角认识佐剂作用机理，为新型佐剂的开发提供新思路。

传统疫苗佐剂研究主要基于试错法，缺乏明确的理论依据。我们研究发现，内源性危险信号硫酸乙酰肝素可有效增强小鼠体液及细胞免疫应答，具有很好的佐剂效应，但其具体的作用机制尚不清楚。。本课题组依据美国哈佛大学医学院Pandolfi 教授领导的研究小组提出的竞争性内源RNA 假说的基础上拟从ceRNA这样一个全新的视角认识佐剂硫酸乙酰肝素的作用机理。.完成了树突状细胞的诱导、刺激以及不同佐剂刺激组DCs表面标志的表达情况；FITC-Dextran检测佐剂刺激之后对DCs吞噬功能的影响；胞内染色-流式细胞术检测佐剂刺激之后不同实验组DCs所产生的细胞因子特征。选取 0h、12h、24h 及 48h 样本进行microRNAs 深度测序及mRNA和lncRNA 芯片检测；运用生物信息学方法筛选差异表达的 miRNA，我们发现下调的有：miRNA-122、 miRNA-222、miRNA-29c、miRNA-194；上调的有：miRNA-21、miRNA-20a、miRNA-29a、miRNA-155、miRNA-26a、let-7b、miRNA-126、miRNA-503、miRNA-181a、miRNA-20b、miRNA-1，这些miRNAs对于整个网络的构建及稳定性非常重要，可能是硫酸乙酰肝素发挥其佐剂作用的重要microRNA。.HS刺激DCs的表达谱芯片数据，结果发现佐剂HS刺激DCs后Toll-like receptor信号通路显著被激活，NF-kB, TRAF3和IRF7 早在佐剂刺激后12h就被激活，而MyD88是被佐剂刺激后48h才被激活，共刺激分子CD80和CD86是在佐剂刺激后24h被激活，因此我们推测HS刺激DCs成熟主要是依赖TRIF信号通路而非依赖MyD88信号通路。.对显著性趋势里差异的 microRNAs 进行靶基因和靶 lncRNA 预测，挑选出显著性趋势里差异 lncRNA，结合之前的表达谱结果，通过计算方法构建网络（Dynamic-lncRNA-mRNA-Net），找到影响 mRNA 表达的调控 lncRNA，及网络中起中心调控作用的 lncRNA；通过 mRNA-microRNA，lncRNA-microRNA 靶向预测数据库，对其靶向关系进行预测，通过表达谱的检测数据进行共表达能力计算 mRNA-lncRNA 之间的调控关系；结合前一步找