青海湖嗜盐菌种群系统发育与Ectoine合成调控机制研究

青海湖是青藏高原生物多样性最丰富的宝库，也是极端微生物基因资源的宝库，作为国家级自然保护区，被列入国际重要湿地名录。其海拔3195米，水温低，含盐度为6%，其中富聚嗜盐菌。青海湖嗜盐菌在高盐、低压、缺氧环境中生存，具有典型的生理生化适应性,而对其嗜盐特性、种群多样性、系统进化和相容溶质渗透压调节机制及抗盐碱化的应用研究，具有重要的基础理论研究意义。本项目旨在通过微生物富聚、筛选分离青海湖优势嗜盐菌种质资源，研究其耐盐特性；利用基因克隆和测序技术，构建青海湖嗜盐菌种群系统发育树；利用基因工程手段，克隆表达四氢嘧啶（Ectoine）基因簇ectABC，构建青海湖ectABC基因簇物理图谱；构建以E.coli为载体的基因工程菌，对照研究耐盐能力；探讨ect操纵子参与的渗透压调节机理，为应用研究提供有力的理论支持。重组耐盐基因可用于高盐污水处理系统和西部农作物抗盐碱化生物工程，具有重要的经济价值。

青海湖是我国境内最大的内陆咸水湖泊，水体中嗜盐微生物的生存现状、嗜盐菌种质资源分布和种群进化定位尚不明确。青海湖嗜盐菌在高盐、低压、缺氧环境中生存，具有典型的生理生化适应性。鉴于高原地区生态环境的优势，对其嗜盐特性、种群多样性、系统进化和相容溶质Ectoine合成机制的基础研究，具有重要的基础理论研究意义。主要研究如下：(1) 利用OSM培养基获得了35株青海湖嗜盐菌种质资源，并构建青海湖嗜盐菌种群系统发育树和确定了青海湖嗜盐菌种群进化定位。(2) 确定了5株优势嗜盐菌，并研究了生长温度、pH和盐度（Na+、K+、Mg2+）等因素与Ectoine积聚的定量关系。通过采用80%乙醇法抽提胞内Ectoine，HPLC分析表明：大多数青海湖中度嗜盐菌胞内积聚Ectione；在最适生长盐度下，优势中度嗜盐菌QHL1、QHL5、QHL10、QHL26 和 QHL28 的胞内Ectione含量分别为258.60、325.47、208.8、292.31和295.13µg/ml，以此初步获得5株具有Ectione高产潜力的野生菌株。 (3) 利用染色体步移技术，成功地克隆并表达Ectoine的合成ectABC基因簇，构建了青海湖优势嗜盐菌Ectione合成基因簇物理图谱，并采用生物信息学的技术手段分析了ectABC操纵子上游调控序列：启动序列、操纵序列和调节序列。青海湖嗜盐菌QHL1的ectABC操纵子全长序列3580bp，结构基因ectA(579bp)、ectB(1269bp)与ectC (390bp)串联排列；ectA与ectB间隔109bp，ectB与ectC间隔91bp；ectA上游调控序列635bp。基于生物信息学预测分析：两个启动子(δ70与δ38)和若干未知功能的保守模序存在于QHL1的ect操纵子上游。(4) 成功实现了ectA、ectB与ectC基因的异源表达，并构建了重组ectABC基因工程菌(E.coli BL21, pET-28a (+)-ectABC)，分析了耐盐能力。重组ectABC基因工程菌，与对照E.coli BL21相比，具有较高的盐耐受能力，但胞内Ectoine合成量却偏低，尚需深入研究。