COLD-PCR/探针熔解曲线技术定量检测CHB患者HBV RT区准种及其意义

Detection of hepatitis B virus (HBV) quasispecies (QS) in the reverse transcriptase (RT) region has significant predicted values during nucleos(t)ide analogues (NAs) treatment in chronic hepatitis B patients. However, until now, there is no high-throughput technology for the detection of QS in the clinic due to the complexity and diversity of HBV QS. In our previous work, we have successfully established COLD-PCR for qualitative detection of multiple mutations. In this study, we intend to establish COLD-PCR in conjunction with probe-based fluorescence melting curve analysis (FMCA) technology to evaluate the characteristics of HBV QS. We develop a highly sensitive COLD-PCR to improve the amplification efficacy in detecting low-level mutations and combine with type-specific FMCA to analyze HBV genotype, variety and proportion of mutations to establish a highly sensitive, simple, inexpensive, practical and high-throughput tool for quantitative detection of multiple mutations in clinic. Dynamic study of the HBV RT QS by this novel method can help to explore the characteristics and regularities of the development of HBV QS, also to discover the relationship between HBV QS and the curative effect with NAs, which may lay a foundation for personalized diagnoses and treatment in the CHB patients.

慢性乙型肝炎（CHB）患者核苷（酸）类似物（NAs）治疗过程中，HBV逆转录酶（RT）区准种检测对于预测NAs疗效有重要价值。然而，由于不同基因型HBV准种存在复杂性和多样性，目前尚无法常规高通量定量检测准种。前期我们已成功构建低变性温度共扩增PCR（COLD-PCR）用于HBV DNA多位点突变的定性检测。本研究拟采用可富集低比例突变DNA的COLD-PCR法，结合型特异性探针熔解曲线，建立一种多位点突变联合定量检测的COLD-PCR/探针熔解曲线技术，实现一次反应同时检测HBV基因型、突变类型及突变DNA的比例，以评估HBV RT区的准种特点。该技术具有高灵敏度、高通量、简便实用和价廉的优点。应用该体系对CHB患者HBV RT区准种进行动态研究，有助于探清准种发生发展的过程、特点和规律，揭示其变化与NAs疗效之间的关系，为不同HBV基因型感染的CHB患者实施个体化诊疗奠定基础。

HBV以准种形式存在患者体内，不同基因型的逆转录酶（reverse transcriptase, RT）区准种变化具有明显的异质性，其对疾病的诊断、治疗及转归的影响亦各异，但目前尚无法常规高通量定量检测准种。本研究拟采用可富集低比例突变DNA的COLD-PCR法，结合型特异性探针熔解曲线，建立一种多位点突变联合定量检测的COLD-PCR/探针熔解曲线技术，实现一次反应同时检测HBV基因型、突变类型及突变DNA的比例，以评估HBV RT区的准种特点。基于以上的研究思路，本项目的研究结果主要有：1.成功建立锁核酸修饰的COLD-PCR//探针熔解曲线技术，该体系对单一突变DNA的检测灵敏度为1%（突变型:野生型比例为1:100）；对HBV DNA定量检测的精密度波动在2.58%~4.42%，对不同单位点突变DNA比例的标本检测精密度稳定在3.35%~6.49%；检测HBV DNA线性范围为：5.0 E+02 IU/ml~5.0 E+09 IU/ml；并且该技术具有高灵敏度、高通量、简便实用和价廉的优点，尤其适合在一般临床基因扩增实验室推广应用。2.应用该体系对CHB患者HBV RT区准种进行动态研究，发现HBV感染不同阶段RT区基因突变数/突变比例为：HBeAg阳性感染组（0/0.0%）＜HBeAg阴性感染组（16/4.5%）＜HBeAg阳性肝炎组（30/5.5%）＜HBeAg肝炎组（36/6.5%）；在接受ETV治疗的CHB患者中，发生病毒学应答组的HBV RT区突变比例在基线及4周时均＜4%，而应答不佳组的突变比例则大部分≥4%；这些研究结果有助于区分不同阶段的HBV感染，并为抗病毒治疗启动及治疗效果的预测提供了新的实验依据。3.结合本课题组在研究过程中发现的CHB患者高敏HBV DNA和乙肝外膜大蛋白（HBV-LP）的检测结果，提出了基于COLD-PCR/FMCA检测技术的CHB精准管理流程，即推荐HBV感染患者首先采用本研究构建的COLD-PCR/FMCA技术进行检测，根据检测到的HBV DNA浓度、基因型、突变情况并结合HBV-LP水平进行分层管理，其后依据诊疗过程中这些指标的动态改变，决定启动抗病毒治疗及预测其治疗效果，从而实现对CHB患者的精准诊疗。