肠道病毒71型3A蛋白通过增强外泌体的分泌参与病毒感染的研究

Studies have shown that exosomes play an important role in the regulation of virus infection, such as HIV, but there is no report about the exosomes in the process of EV71 infection. We have found that in the process of enterovirus 71 (EV71) infection, exosomes carrying virus components can infect neuroblastoma cells SK-N-SH. At the same time, we first found that EV71 non-structural protein 3A can affect the secretion of exosomes, and anchored in the exosomes. We will investigate the role and molecular mechanism of 3A protein regulating the secretion of the exosomes, and the function of 3A+ exosome during EV71 infection. On this basis, by using of animal models of EV71 infection, we want to verify that 3A protein could promote the secretion of exosomes, participate in EV71 infection in one-day-old BALB/C rats. Hand, foot and mouth disease (HFMD) patients infected by EV71 were divided into two groups, patients with mild and severe symptom. Regression analysis method are used in the study of correlation between the level of 3A protein in equal exosomes and the development of the disease. We will evaluate the level of 3A protein in equal exosomes as a warning indicator of disease development. This study will clarify that the EV71 infected cells through exosomes is a new pathogenic mechanism.

已有研究表明外泌体在HIV等病毒感染的过程中发挥了重要的调控作用，但目前尚无外泌体在EV71感染过程中的报道。本课题组发现在EV71感染过程中，外泌体通过携带病毒成份，能直接感染神经母细胞瘤细胞SK-N-SH。同时，我们首次发现EV71的非结构蛋白3A能够影响外泌体的分泌，并锚定于外泌体。本项目拟进一步研究在EV71感染SK-N-SH细胞的过程中， EV71 3A蛋白对外泌体产生过程的调控作用及其分子机制，以及携带3A蛋白的外泌体在病毒感染中的作用。在此基础上，利用EV71感染动物模型——一日龄BALB/C鼠验证3A蛋白促进外泌体分泌、参与感染的作用和机制。将EV71感染的手足口病患者分为轻症和重症两组，通过logistic回归分析患者血清等量外泌体中的3A蛋白含量与疾病发展的相关性，评价其作为疾病发展的预警指标。本项目将阐明EV71通过外泌体途径感染细胞是其致病的一种新机制。

肠道病毒71型（EV71）属于小核糖核酸病毒科肠道病毒属，是引起重症手足口病（HFMD）最重要的病原体之一。有研究表明病毒感染来源的外泌体在病毒传播和致病过程中发挥了重要的作用。本研究分别在细胞和动物水平探讨EV71对外泌体分泌的影响，利用BCA微量蛋白检测试剂盒检测外泌体总蛋白浓度；NTA分析技术检测外泌体粒径大小和分布，CD63抗原ELISA检测外泌体含量，确认了病毒感染能够在体内和体外促进外泌体的释放。. 随后，通过对病毒非结构蛋白的筛选，利用3A蛋白表达载体以及3A蛋白位点的突变病毒株，确认病毒非结构蛋白3A可以促进外泌体的释放。为进一步研究3A蛋白对外泌体的调控作用，我们利用免疫荧光技术、WB技术分析了研究3A蛋白对早期内体、晚期内体、MVBs和ILVs的影响，发现发现3A蛋白导致胞内MVBs和ILVs数量减少，而早期内体数量不变，提示包含ILVs的MVBs可能释放增多。最后，我们通过AP-MS筛选、IP验证Rab27a是3A蛋白调控作用的靶蛋白。3A与Rab27a相结合，共定位于胞质中。同时，利用免疫共沉淀技术确证了3A蛋白能够降低Rab27a的泛素化水平，减少Rab27a的降解从而稳定Rab27a的蛋白水平，促进了MVBs和质膜的融合，增加了外泌体的释放。我们收集EV71轻症和重症感染者的样本，通过外泌体提取试剂盒分离外泌体，再通过CD63抗体磁珠提纯，QRT-PCR检测病毒RNA，结果表明， EV71重症感染者血浆外泌体中能检测到EV71 RNA；而粪便中只能检测到病毒核酸，而未能提取到外泌体，可能是由于胆汁的溶解作用。而轻症患者血浆中未能检出病毒核酸，仅粪便中检出病毒核酸。提示我们，血浆中包含病毒核酸的外泌体可能与重症感染有关。. 本研究阐明了EV71病毒3A蛋白通过与Rab27a蛋白的相互作用，减缓Rab27a蛋白的泛素化降解，从而促进了外泌体的释放，增强病毒的感染。本研究进一步完善了肠道病毒的致病机制。