重组黏玉米谷氨酰胺转氨酶作用乳蛋白改善酸乳凝胶特性的研究

Transglutaminase (TGase) is an enzyme that can catalyze the acyl-transfer reaction between γ-carboxyamide groups of glutamine residues and ε-amino groups of lysines or other primary amines. The results of this activity lead to the improvement of protein functional properties, so this enzyme is widely used in the food industry. Plant TGase has its unique functions and properties, but the research on plant TGase is limited, because of the difficult separation and purification and low yield. Base on the previous research, the mutant library of Zea mays TGase (TGZ) is constructed by directed evolution through error-prone PCR and the objective strains are rapidly screened by co-expressed of TGZ and green fluorescent protein in pichia pastoris GS115. The catalytic mechanism of TGZ is elucidated by dynamic light scattering, nuclear magnetic resonance spectroscopy and isotope-labeled method. TGZ is used in the yoghurt fermentation, the effect on yoghurt quality is studied, the cross-linking effect of TGZ on yoghurt is analyzed by proteomics and small angle neutron scattering method, and this will further clarify the role of TGZ to improve the yoghurt gel properties. This study will be lay the theory foundation for the application of TGZ in yoghurt or other dairy products, and has a very important significance in developing a safe and efficient food additive.

谷氨酰胺转氨酶（TGase）是一种催化酰基转移反应的酶，它能改善蛋白质的功能特性，在食品工业中有着广阔的应用前景。植物来源TGase具有独特的功能和性质，但其分离纯化困难、得率较低，限制了研究者对其催化机制及应用的研究。在前期研究工作基础上，本项目以黏玉米谷氨酰胺转氨酶（TGZ）为研究对象，利用易错PCR进行定向进化，构建TGZ突变体库，通过与绿色荧光蛋白在毕赤酵母中的共表达实现TGZ高表达菌株的快速筛选；利用动态光散射、核磁共振光谱和同位素标记等方法阐明TGZ的催化机制；将TGZ用于酸乳发酵，研究其对酸乳品质的影响，并利用蛋白质组学和小角中子散射技术分析TGZ在酸乳中的交联作用，进一步阐明其对酸乳凝胶特性的改善作用。此研究为TGZ在酸乳制品及其它乳制品中的应用奠定理论基础，对开发安全高效的食品级添加剂具有重要意义。

谷氨酰胺转氨酶（TGase）是一种通过催化酰基转移反应，使蛋白质之间产生共价交联而改善蛋白质功能特性的酶。植物源的TGase由于具有独特的功能和特性而备受关注，但是其分离纯化步骤繁琐且得率偏低，限制了研究者对其催化机制及应用的进一步研究。黏玉米谷氨酰胺转氨酶（TGZ）是一种新型植物TGase，本文研究了毕赤酵母系统中不同类型启动子调控TGZ的分泌表达，从而筛选高表达菌株，并对重组TGZ的性质及功能特性进行了研究。. 本研究利用组成型启动子PTEF1和诱导型启动子PFLD1构建新型表达载体，并在P. pastoris中进行诱导表达。发现PFLD1菌株表达的TGZ活力为635mU/mL，高于PTEF1菌株表达的酶活，479mU/mL。将PFLD1菌株表达的TGZ分离纯化后的比活为0.4U/mg。通过单因素、P-B设计及响应面分析对PAOX1菌株的发酵条件进行了优化，最佳的表达条件为：重组子用37mL pH6.5的改良BMMY培养基（含有0.006% PMT1和0.07%油酸）重悬至OD600为2时，于28℃诱导96h，每24h时补加100%甲醇，使其终浓度为1.31%，同时补加0.006% PMT1和0.07%油酸。在该条件下TGZo的活性达到1078mU/mL，比优化前提高了1.8倍。. 对TGZ酶学性质的研究表明，该酶的最适反应温度为45℃，具有较稳定的耐热性。该酶的最适反应pH为8.0，具有较强的耐碱性。不同金属离子对酶活性有一定的影响，其中低浓度的Ca2+对重组酶的促进作用最强。两种酶对不同底物蛋白的交联作用研究表明，TGZ对酪蛋白和大豆分离蛋白有显著的交联作用，但对乳清蛋白无交联作用。. 将重组TGZ作用于乳蛋白浓缩物，发现2U/g酶浓度，pH7，温度35℃下反应2h后MPC凝胶有较好的凝胶强度和持水力。对其催化反应机制研究表明，TGZ催化的MPC在凝胶化的早期开始，并形成了大于100μm的大聚集体。 酸诱导的MPC凝胶经TGZ处理后显示出连续的弹性增长。将经TGZ处理过的MPC作为蛋白质补充剂添加到酸奶发酵中，发现经TGZ处理的MPC可以极大的改善酸奶的质量和功能特性。本研究为TGZ大规模生产和应用奠定了基础，对食品产业倡导的开发高品质和安全食品具有重要意义。