汉坦病毒反向遗传学操作系统的建立及聚合酶基因功能研究

汉坦病毒引发肾综合征出血热是一个全球性的重要传染病，我国是受汉坦病毒危害最为严重的国家。汉坦病毒是分节段的负链RNA病毒，RNA病毒的结构特点和不稳定性成为研究汉坦病毒的主要障碍，而反向遗传学技术能很好解决这一难题，但目前未见成功建立汉坦病毒反向遗传学系统报道，建立反向遗传学操作系统关键是装配功能性核糖核蛋白复合物。本研究利用RT-PCR获得汉坦病毒完整L/M/S基因，将L/S插入真核表达载体中转染细胞，筛选出表达汉坦病毒L和N蛋白细胞系，得到拯救汉病毒必需的反式作用蛋白L和N蛋白；构建含RNA聚合酶 I启动子和终止子的质粒，转录病毒负链RNA，建立汉坦病毒反向遗传学系统。汉坦病毒的聚合酶基因具有复制酶、转录酶和核酸内切酶等功能，但对于相应功能区的定位远未明确，利用建立汉坦反向遗传学操作系统，运用分段表达、定点突变、基因缺失等技术，明确汉坦病毒聚合酶功能区并进行汉坦病毒聚合酶基因功能研究。