DNA甲基化介导Sly-miR171和靶基因LeCTR1调控番茄果实采后衰老的分子机制

Study on the mechanism of DNA methylation modification in postharvest senescence of tomato fruit can provide theoretical basis for research and development of postharvest fresh-keeping technology and strategy, and also provide an important theoretical foundation for molecular biology technology to modify these modified target sites and delay fruit senescence. On the basis of the previous research, this project intends to make use of the CRISPR/Cas9, STTM and other molecular biology technology, to further analyze the single or more nucleotides methylated modification on aging signal perception and response mechanism in the three region of CpG/CHG/CHH in the promoter of Sly-miR171, to clarify the molecular mechanism of postharvest fruit senescence mediated by DNA methylation of Sly-miR171 and target LeCTR1 gene in the ethylene pathway. This research can screen epigenetic targets for the postharvest fruit senescence, and provide strategies and theoretical foundation for the preservation of fruit and cultivation of late-maturing fruit varieties.

研究番茄果实采后衰老的DNA甲基化修饰调控机制，不仅能为研发及制定果实采后保鲜技术及策略提供理论基础，还能为分子生物学技术改造这些修饰靶位点延缓果实衰老奠定重要的理论基础。本项目拟在前期研究基础上，利用CRISPR/Cas9、STTM等各种分子生物学技术，进一步分析Sly-miR171启动子3个mCpG/CHG/CHH区域单碱基或多碱基甲基化修饰对衰老信号的感知和应答机制，及乙烯代谢途径中DNA甲基化修饰介导的Sly-miR171及靶基因LeCTR1调控果实采后衰老的分子机制，筛选果实采后衰老的表观遗传学修饰靶位点，为果实贮藏保鲜策略制定及培育晚衰果实品种奠定理论基础。

从基础上研究果实衰老的遗传机制和分子调控机制，认识果实衰老变化过程，不仅能为水果贮藏保鲜方法提供新的思路，还能对认识植物物种生存、繁衍以及进化机制具有十分重大的意义。本项目主要研究了番茄果实采后衰老的DNA甲基化修饰调控机制和Sly-miR171及靶基因LeCTR1（GRAS24）调控果实采后衰老的分子机制。本研究以Micro-Tom番茄为材料，利用STTM技术构建番茄miR171d和miR171e干扰载体，并通过遗传转化获得转基因番茄植株。对番茄中miR171d/e及靶基因表达模式进行了分析，发现miR171d在番茄大多数组织中的表达量远远高于miR171e。miR171d/e沉默对番茄果实发育和成熟具有重要的作用，靶基因在miR171d/e沉默番茄果实中较高，且miR171d/e与SlGRAS24呈负相关，说明番茄果实在早期发育中的细胞膨大可能与miR171d/e-SlGRAS24模式有关。早期果实的发育可能影响了采前果实的成熟。miR171d/e受到干扰后表达量下调，导致STTM171d/e番茄果实提前破色，说明miR171d/e负调控果实成熟。miR171d/e参与了番茄果实采后成熟和衰老的调控。通过对番茄果实成熟期间乙烯释放量的测定，发现miR171d/e沉默果实提前了呼吸跃变进程。对类胡萝卜素合成途径中SlPSY1、SlPDS、SlZDS、SlLCY-Beta和SlLCY-E基因的表达进行测定，发现miR171d/e沉默导致类胡萝卜素合成基因的表达上调，促进了类胡萝卜素的合成和积累，从而影响了果实破色时间。此外，我们对番茄果实成熟衰老过程中DNA甲基化动态变化进行了检测，结合BC方法与新一代高通量测序技术，对番茄果实衰老过程中的番茄样本进行了全基因组甲基化测序，筛选到了大量甲基化差异区域，并结合BSP技术研究番茄衰老发生机制，研究发现Sly-miR171b前体Sly-pri-miR171b的DNA序列启动子2.5 kb处有一个含有13个CG的CpG岛区域。番茄果实在高温下，Sly-pri-miR171b启动子CpG岛区域CG的甲基化程度明显升高到38%和54%，抑制了Sly-miR171b的表达，同时激活了靶基因SlGRAS24表达，从而促进了衰老。本研究结果为了解和制定呼吸跃变型果实采后贮藏保鲜策略提供重要的基础和依据。