一种新型λ-卡拉胶酶的基因克隆、结构与功能关系及作用机制研究

糖生物学已成为二十一世纪生命科学研究的前沿和热点，而糖水解酶是糖生物学研究的核心内容之一。最近，项目组从海洋Cellulophaga sp. QY201发酵液上清液中分离纯化了一种λ-卡拉胶酶，酶学性质和部分氨基酸测序结果表明，该酶是一种结构和功能全新的糖水解酶。本项目旨在克隆λ-卡拉胶酶全长基因，确定其所属糖水解酶家族；以系列λ-卡拉胶寡糖为底物，利用位点作图法（Subsite mapping），确定酶的催化腔大小和底物结合位点，阐明其结构与功能关系；通过实时检测不同时间点酶解产物的氢谱变化规律，确定酶的水解机制。本项目的研究意义在于：① 发现一种具有自主知识产权的新型λ-卡拉胶酶，丰富糖水解酶的多样性，为深入研究糖水解酶的结构与功能关系提供理论依据和技术支撑，推动糖生物学研究的发展；② 为相关藻类的基础研究和育苗育种、具有药用价值的卡拉胶低聚糖的制备等领域提供新的工具酶。

卡拉胶是以1,3-β-D-吡喃半乳糖和1,4-α-D-吡喃半乳糖作为基本骨架，交替连接而成的硫酸多糖，主要有κ-型、ι-型和λ-型三种卡拉胶，其二糖单元分别含有1个、2个、3个硫酸基。卡拉胶酶是一种特异性地水解卡拉胶的β-1,4糖苷键的糖水解酶。已知的κ-卡拉胶酶均属于糖水解酶16家族，其降解κ-卡拉胶的机制为保持型，主产物为硫酸κ-新卡拉二糖和硫酸κ-新卡拉四糖。ι-卡拉胶酶归属于GH82家族，降解ι-卡拉胶的机制为转变型，主产物为硫酸ι-新卡拉四糖。迄今国际共享数据库中λ-卡拉胶酶只有一个，降解λ-卡拉胶的机制为转变型，水解主产物为四糖和六糖。在本项目中，项目组克隆了一种新型λ-卡拉胶酶CglA的全长编码基因，cglA全长1023 bp，编码一个340 aa的蛋白质，理论分子量为36.3 kDa。序列相似性分析表明，该酶与已知酶序列相似性低，属于一个新的糖水解酶家族。CglA最适温度和pH为40 C和pH7.6，在30 C下和pH6-9比较稳定，降解λ-卡拉胶的最终产物为二糖和四糖。以系列λ-卡拉胶寡糖为底物，利用位点作图法确定了酶的催化腔有8个底物结合位点（-4~+4），最小降解底物为λ-卡拉六糖，六糖在催化腔中占据-4~+2位点。CglA不同时间降解产物的1H-NMR谱图结果表明，在反应初期G2SrH1α和D2S6SnrH4的质子峰积分面积相等，随着水解反应的进一步进行，它们的峰值不断增加，但是G2SrH1α增加的速度要小于D2S6SnrH4α增加的速度，推测可能是α异头碳变旋为β异头碳构象，因此该酶的催化机制应当是倒位型。综上所述，λ-卡拉胶酶CglA是一种结构和功能全新的糖水解酶，代表了糖水解酶的一个新家族。