线粒体能量代谢指纹谱用于中药活性成分筛选与分析的研究

本项目针对中药多成分、多靶点、整体协同作用的特点，提出以动物细胞中线粒体能量代谢作为研究中药复杂活性成分与能量代谢、药效之间相关性为切入点，结合多维液相色谱－质谱分析手段建立适用于中药活性成分与药理活性间关系表征方法和技术平台。首先以反映中药方剂中相关化合物生物转化信息的体外药物代谢指纹谱获得直接作用组分。在此基础上研究中药活性成分对线粒体能量代谢的调控规律，得到表征能量代谢特性信息的能量代谢指纹谱，筛选反映药效强弱的生物标记物，进而阐述活性成分在线粒体能量代谢机制中的调控机理。最终构建用于中药活性成分的快速筛选和分析的新方法，并从分子水平上解释中药活性成分的药理机制。

天然药物中的活性成分和生物大分子之间存在相互作用，这种作用机制的研究对于天然药物活性成分分析以及药理作用阐明具有重要的意义。本项目首次提出以线粒体为靶点，以体外相互作用为研究内容开展天然药物活性成分分析新方法的研究，并通过研究天然药物对线粒体能量代谢以及酶活性的影响阐述两者间的相互作用机制。. 建立了从大鼠心脏中提取具有活性的线粒体方法，并对线粒体提取物进行了鉴定。在具有活性的线粒体的基础上又从中提取出高能磷酸化合物，随后建立了分析高能磷酸化合物的液相色谱方法，并进行了定性及定量分析。同时考察了丹参及其标准品隐丹参酮、丹参酮Ⅰ和丹参酮ⅡA对大鼠心脏线粒体中腺苷酸及能荷的影响，及其随时间的变化情况。. 采用体外相互作用的方法，测定了SDH、ATPase、T-SOD活性及MDA含量在相互作用前后发生的变化，以此来判断药物在体外对能量代谢的影响。结果表明，丹参提取液在体外可使线粒体中SDH、T-SOD酶活性升高、可降低ATPase活性，使机体内MDA含量升高。从单一标准品来看，隐丹参酮可使SDH活性增高，ATPase活性降低，对T-SOD活性无显著性影响，MDA的机体含量升高。丹参酮Ⅰ和丹参酮ⅡA均使线粒体中SDH活性升高，可降低ATPase和T-SOD活性，MDA含量略显下降。. 通过考察线粒体与丹参提取液在体外相互作用的条件，建立了以SD大鼠心脏线粒体体外相互作用指纹分析方法，以此方法对单味中药丹参提取液及其主要活性成分隐丹参酮、丹参酮Ⅰ、丹参酮ⅡA进行体外相互作用分析。对差异性较大的谱图进行了初步分析解释。其中充入空气的相互作用体系，通过液相色谱检测发现有新的色谱峰生成，并对其进行了重点考察。通过HPLC-MS技术对新出现的化合物进行了分析，测得其分子量为212.02，在223.7nm处具有最大紫外吸收。同时考察了三种标准品随着相互作用时间对新色谱峰化合物的影响。. 通过本项目研究建立了体外能量代谢指纹谱用于中药活性成分的研究方法，可以开展活性成分与线粒体中高能物质及酶之间相互作用的研究，为揭示中药通过调节线粒体能量代谢的作用机制提供了依据。