三维直写仿生纤维支架双向诱导牙周组织重构的研究

Periodontitis is a major cause of tooth loss for adults. Periodontia reconstruction based on infection control is the key solution to periodontal treatment. However, the regeneration of cementum and periodontal ligament complex is still under research all over the world. In our previous study, we prepared a collage/PCL/nHA based fibers membrane with good biocompatibility by electrospinning. Moreover, a novel recombinant human cementum protein was produced and was proved to be able to induce stem cells differentiating towards cementoblast instead of osteoblast. Based on above work, the goal of the project mainly focuses on the fabrication of 3D porous fibrous film simulating the architecture of periodontal ligament based on the novel direct writing electrospinning. This 3D porous and biphasic guiding film is achieved by loading cytokine rh-CEMP1 on the one side and rh-GDF5 on the other side for inducing periodontal ligament cells to cementoblasts and periodontal fibroblasts correspondingly when periodontal ligament cell sheets are used to attaching to the scaffold. The project provides a novel approach to reconstruct periodontal tissue for periodontitis patients and will lay a solid foundation for periodontia reconstruction in clinical applicable.

牙周炎是成人失牙最主要的原因。在控制感染的基础上重建牙周组织是牙周病治疗的最终目标。然而迄今为止，牙骨质及其与牙周膜界面的修复再生还未能实现，牙周组织再生治疗技术尚不成熟。我们在前期研究中，采用静电纺丝技术制备了具有良好生物相容性的纳米羟基磷灰石涂层PCL/胶原纤维膜。同时获得一种新的重组牙骨质结构蛋白rhCEMP1，证实其具有诱导干细胞定向成牙骨质细胞分化、抑制向成骨细胞方向分化的作用。本项目拟在此基础上，采用三维直写电纺技术，制备具有牙周膜主纤维结构特征的PCL/胶原三维多孔膜，在其两面分别负载诱导成牙骨质细胞和成纤维细胞分化的细胞因子rhCEMP1和rhGDF5，形成具有双向诱导功能的三维多孔支架材料，复合牙周膜细胞膜片技术，实现工程化牙周组织的构建。本项目针对牙周炎患者牙周组织重建的问题，首次提出三维支架膜工程化牙周组织构建的新途径，为实现临床实用性牙周组织重构新技术打下基础。

牙周病是一种影响广泛的高发病，理想的牙周再生，应同时包括牙骨质、牙周膜和牙槽骨的再生。牙骨质的再生是是目前的牙周组织复合体恢复研究中的热点和难点，是牙骨质-牙周膜界面结构再生的先决条件，因此必须采用特异性生长因子诱导牙骨质再生。静电纺丝技术制备仿细胞外基质结构的微-纳尺度的超细纤维膜，无纺布结构的纤维膜能够促进干细胞的骨相分化而取向结构的纤维膜能够促进干细胞韧带相关基因的表达。研究结果：（1）通过大肠杆菌表达系统得到可与CEMP1抗体特异性结合的rhCEMP1，分子量为34kDa。此蛋白诱导人牙周膜细胞后可使其CEMP1 mRNA 表达量升高，证明大肠杆菌原核表达和Ni柱纯化可以获得浓度及纯度较高并具有生物活性的CEMP1蛋白。（2）在仿生生物矿化体系观察浓度范围为0~100 μg/ml 的CEMP1对HA晶体48小时生长过程的调控作用，确定CEMP1在体外可以通过提高局部浓度诱导排列整齐的HA晶体形成。（3）通过选用ACP缓释载药系统合成rhCEMP1/ACP纳米缓释颗粒。分析四种rhCEMP1/ACP纳米缓释颗粒的载药量和包封率的关系以及释放谱，数据表明主要有三种释放方式，首日爆释、第一周慢型释放以及一周后的后期快型释放，可以针对牙骨质再生的实际需要选用合适的释放谱型的rhCEMP1/ACP纳米缓释颗粒。（4）通过静电纺丝的方法获得了具有多孔纳米结构，表面粗糙度高，亲水性良好的复相ACP/PCL/COL支架。通过rhCEMP1/ACP/PCL/COL支架在体外与PDLC共同培养7天，可抑制PDLC增殖；促进成牙骨质细胞分化因子CAP和CEMP1表达，抑制成骨细胞分化因子OCN和OPN表达。（5）通过搭建近场静电纺丝装备，获取取向纤维丝/无纺布纤维丝，发现近场电纺能够制备间距走向可控的取向纤维丝，定向诱导牙周膜干细胞的有序排列，而干细胞的形态能够进一步影响细胞的分化方向，取向纤维结构可能能够在牙周膜韧带仿生再生当中应用。（6）成功搭建取向纤维膜制备装置并获取取向纤维膜，hPDLCSc 能在纤维膜上较好的黏附、增殖，且随着培养时间的延长，取向结构的纤维膜能够显著影响细胞形态与排列。