纳米自组装钙磷基质生物矿化仿生复合种植牙涂层材料

诱导种植体周围组织再生是提高种植牙成功的关键问题。但到目前为止，尚无具有牙骨质功能特征的种植体涂层材料。我们的前期研究通过重组的方法，获得一种新的牙骨质特征蛋白CEMP1。据此提出利用自组装原理，用CEMP1与磷酸钙制备一种钙磷基质仿生复合纳米材料，用于种植牙涂层，以发挥诱导牙周组织再生的作用。本项目利用人重组蛋白，在适宜环境下使带正电荷的金属离子与带负电荷的hrCEMP1组装，使hrCEMP1在特定环境中控制磷酸钙晶体形成和生长，形成以hrCEMP1为核的弱晶或无定形复合磷酸钙材料，从而在种植牙钛材表面仿生沉淀形成涂层，通过体内、体外实验评价仿生材料对牙周组织再生修复的诱导作用。本研究的关键是对重组蛋白与金属离子共价结合的条件确定、重组蛋白控制磷酸钙晶体生长中的条件优化和涂层材料中人重组蛋白的控制释放。本项目的完成将提供一种具有完全自主知识产权的新材料，为实现口腔临床医学转化奠定基础。

牙骨质蛋白1（CEMP1）是一种新的牙骨质蛋白。国内外均处于研究初期阶段，本研究拟通过基因工程技术，制备rh-CEMP1,并采用仿生矿化技术合成rh-CEMP1杂交复合的无定形磷酸钙支架材料。. 实验分为四个部分，即.1.hrCEMP1真核表达载体的构建：扩增rhCEMP1基因，重组的pWX530-rhCEMP1在大肠杆菌DH5α中扩增后，通过酶切电泳鉴定和DNA测序所构建的质粒。结果表明：电泳鉴定和DNA测序证实重组质粒插入基因序列为rhCEMP1 cDNA。.2.hrCEMP1真核表达载体在成纤维细胞中的表达：利用高效率的阳离子聚合物将经过鉴定的pcDNA3.1-CEMP1转染入NIH3T3细胞，通过对重组质粒酶切鉴定以及DNA测序分析，证明真核表达重组质粒pcDNA3.1-CEMP1构建成功，开放阅读框架正确，转染细胞株的RT-PCR结果中观察到特异性242bp片段。成功构建含rh-CEMP1基因真核表达质粒，并可在NIH3T3细胞株中mRNA水平表达。.3.hrCEMP1在酵母中的表达、分离和提纯：表达载体pWX530-rhCEMP1转入酵母感受态细胞，酵母经氨基酸营养缺陷型筛选后培养表达。利用SDS-PAGE电泳和ELISA分析蛋白表达情况，离子交换层析提纯蛋白。结果表明:重组质粒成功转入酵母细胞，通过SDS-PAGE和ELISA检测rhCEMP1表达成功。构建的表达载体pWX530-rhCEMP1能转入酵母细胞并成功表达。.4.纳米磁性颗粒复合无定形磷酸钙的制备：以四水硝酸钙（Ca(NO3)2•4H2O）和磷酸氢二铵（(NH4)2HPO4）为钙源和磷源，混合反应3h后，抽滤干燥，利用红外光谱、场发射扫描电镜、高分辨透射电镜及X 线衍射分析。结果显示红外光谱中600–500 cm-1处PO43-没有出现双峰，而是明显的单峰；SEM图片也与ACP的经典球形外貌相吻合；XRD图谱中，2θ = 30°左右出现了馒头峰；选区电子衍射也没有出现明显的衍射点，取而代之的是与非晶相对应的非晶环，此结果与ACP典型的非晶特征相一致，证明成功合成了ACP。. 小结：本项目首次成功获得大量的重组CEMP1和rhCEMP1复合材料。进一步的研究将进行体外细胞生物学效应和体内生物反应分析。本项目目前已发表论文6篇，定稿在印论文2篇，已接收国际会议论文2篇。