猪瘟病毒调控抗病毒免疫刺激基因ISG15的分子机制探索

Classical swine fever (CSF) arise economical lose of thousands millions in China each year. The prevention and control of CSF become a very important research title in pigs industry, due to a little has been known for their immunological and pathogenic mechanisms. Immune stimulated gene ISG15 inducing by type-I interferon (IFN-I) exerts antiviral activity via modification of viral proteins by ubiquitination-like system. We found that classical swine fever virus (CSFV) inhibits IFN-I expression, but significantly up-regulate mRNA level and protein expression of ISG15 in vivo and in vitro, implicating that IFN-I does not involve in regulation between CSFV and ISG15. There may be another alternative pathway for CSFV up-regulate ISG15. To specific this finding, in this study our group attempt to determine which CSFV protein influence on ISG15 expression, elucidate molecular pathway of CSFV up-regulate ISG15-that is the molecular mechanism how CSFV inhibits IFN-I and evades early innate immune response of host, and up-regulation of ISG15, and then further to explore the influence over-expression of ISG15 and its ISGylation on replication and transcription of CSFV. These data will be very helpful for anti-viral diseases breeding or provide new idea for prevention and control of CSFV.

猪瘟是猪重要传染病之一，其防控已成为养猪业的重大课题，目前该病的免疫机制和致病机理尚未阐明。抗病毒免疫刺激基因ISG15由I型干扰素（IFN-I）诱导产生，通过类泛素修饰系统标记病毒蛋白发挥抗病毒作用。我们发现猪瘟病毒（CSFV）一方面抑制IFN-I表达，另一方面也引起宿主细胞中ISG15的mRNA水平及蛋白表达量的显著上调，这一现象说明CSFV对 ISG15的调控不受IFN-I直接影响，可通过另外途径进行调节。本项目拟通过研究CSFV蛋白对ISG15分子表达的影响，确定上调ISG15的CSFV蛋白；摸索CSFV蛋白与ISG15分子之间相互调控的主要通路，阐明CSFV感染既可抑制细胞IFN-I的产生，逃逸宿主早期固有免疫应答，又能上调ISG15表达的分子机制；在此基础上进一步摸索ISG15过表达及其ISGylation对CSFV复制转录的影响，为抗病育种或猪瘟免疫新途径提供理论依据。

猪瘟是一种猪的高度传染性和高致死率的疾病，给世界养猪国家造成了巨大的经济损失。本研究小组在体内外实验中均发现，猪瘟病毒 (CSFV) 在不刺激产生干扰素的情况下上调ISG15的表达，同时证明了ISG15能抑制CSFV的转录和复制，因此深入探索了CSFV上调ISG15的分子机制。.1. CSFV基因组RNA通过IFNα/β非依赖途径激活ISG15.CSFV感染PK-15细胞后，检测了细胞培养上清的IFNα/β产生情况及细胞内IFNα/β等一系列细胞免疫相关因子的mRNA和蛋白变化情况，结果显示CSFV感染不能上调IFNα/β的表达，但能上调ISG15表达，推测CSFV通过IFNα/β非依赖的方式上调ISG15。.2. CSFV通过RIG-I/MAVS/IRF1通路激活ISG15.本研究发现CSFV的gRNA可通过剂量依赖的方式激活RIG-I、MAVS、IRF1和ISG15。通过siRNA沉默这一信号通路上的相关蛋白，进一步探索CSFV上调ISG15的分子机制。结果显示，siRNA抑制RIG-I的表达后，CSFV不能上调ISG15的表达，说明RIG-I是ISG15的上游调控分子。同样地，通过MAVS、IRF1和ISG15 siRNA分别抑制目标基因的表达后，检测其下游相关基因的表达变化，发现通路的某一基因被沉默后，其下游基因被抑制，但上游基因不受影响，证明CSFV通过RIG-I/MAVS/IRF1通路上调ISG15表达。.3. IRF1调控ISG15基因功能区的鉴定.本研究发现CSFV感染后IRF1在细胞核内的表达量逐渐增加，说明病毒激活IRF1的入核。为阐明IRF1与ISG15的相互作用机理，本研究构建了一系列含isg15基因5`flanking region的荧光素酶报告系统，发现IRF1通过结合isg15基因5`的-487 — -325区域核苷酸序列调控ISG15的表达，并进一步通过核苷酸点突变实验，证明isg15基因5`的-440 g是IRF1调控isg15基因的关键核苷酸。.CSFV感染后调控ISG15的非干扰素依赖的信号通路以及IRF1调控ISG15基因功能区均为首次报道，这些发现有助于更深入的了解CSFV与宿主蛋白互相作用的过程，发现抗CSFV的靶标蛋白，探索和开发猪瘟防控的新途径。