细胞内Ca2+和Nrf2/ARE信号通路介导雌激素抗氧化保护视网膜神经细胞的分子机制

Our previous study has found that 17β-Estradiol (βE2) has a neuroprotective effect against oxidative stress/apoptosis on retinal nerve cells by increasing the concentration of intracellular Ca2+ ([Ca2+]i) and regualting the expression/activation of an important transcription factor-Nrf2 through PI3K pathway. However, the underlying molecular mechanism is still largely unknown. Based on the previous work, these following three subjects will be investigated in this present project: which channels or pathways are involved in the changes of [Ca2+]i regulated by βE2 through PI3K; how does Ca2+ affect the activation of Nrf2, and which target genes are up-regulated by the activated Nrf2/ARE pathway, by which to exert the antioxidative/anti-apoptotic protective effects in retina. In order to accomplish those objects mentioned above, several advanced approaches including inhibitor blocking, RNAi, gene-overexpression, ChIP and promoter bioinformatics will be applied, and some detection techniques including FACS, Confocal, EMSA, Real-time PCR, Western Blot and immunohistochemistry etc. will be used in the project. Elucidating the molecular mechanism of antioxidative/anti-apoptotic protective effect of βE2 on retinal nerve cells mediated by intracelluar Ca2+ and Nrf2/ARE pathway will provide new strategy for the prevention and cure of retinal degenerative diseases.

近期我们研究发现17β-雌二醇（βE2）在视网膜神经细胞中能激活PI3K信号通路影响细胞内Ca2+浓度（[Ca2+]i），调控重要的转录因子Nrf2的表达与活化，发挥抗氧化抗凋亡的神经保护作用，但其分子机制有待阐明。本项目拟在前期工作的基础上，以视网膜作为研究对象，通过抑制剂阻断实验、RNAi、基因过表达、ChIP及启动子生物信息学等先进的研究手段，结合FACS、Confocal、EMSA、Real-time PCR、Western Blot、免疫组化及凋亡鉴定等先进的检测技术，研究PI3K经哪些通路介导βE2调控[Ca2+]i；Ca2+信号又如何影响Nrf2的活化；激活的Nrf2/ARE通路上调了哪些靶基因的表达、最终发挥抗氧化抗凋亡保护视网膜的作用。阐明Ca2+和Nrf2/ARE信号通路介导雌激素抗氧化抗凋亡保护视网膜神经细胞的分子机制，将为寻求视网膜退行性疾病的防治措施提供新的策略。

氧化应激导致视网膜感光细胞特异性凋亡是视网膜退行性病变发病的主要机制。寻求抗氧化、抗凋亡、保护视网膜感光细胞的有效药物是探索防治视网膜退行性病变的重要途径。本研究课题应用氧化应激刺激建立的体外和体内视网膜神经细胞凋亡模型，首先证明了17β雌二醇（βE2）通过激活PI3K/Akt信号通路，调控下游分子Bax、Cyt-c、Bcl2、GSK-3β、Caspase 9、Caspase 3、NF-κB等凋亡和抗凋亡相关因子以及 [Ca2+]i和抗氧化转录因子Nrf2的表达和活性, 发挥其抗视网膜神经细胞凋亡的作用。进而深入研究了βE2调控 [Ca2+]i和Nrf2/ARE信号通路抗氧化保护视网膜神经细胞的分子机制。发现在氧化应激的刺激下，βE2不仅通过激活PI3K/Akt/CREB信号通路调控L型-电压门控Ca2+通道和IP3R Ca2+通道快速升高 [Ca2+]i，发挥抗凋亡保护视网膜神经细胞的作用，而且通过激活PI3K/Akt信号通路和经典的ER信号通路上调Nrf2的表达，激活Nrf2/ARE通路，上调下游抗氧化相关基因SOD1、SOD2、CAT、GPx1、GPx2、GPx4、Txn1、Txn2、Glrx1、 Glrx2、HO-1等的表达，减低细胞内ROS的生成和MDA的水平，最终发挥抗氧化的保护作用。揭示了Ca2+和Nrf2/ARE信号通路介导雌激素抗氧化抗凋亡保护视网膜神经细胞的分子机制。值得注意的是我们在进行βE2抗氧化机制的研究中，惊奇的发现了在视网膜感光细胞中特异表达的新基因NDRG2，它是 NDRG（N-myc downstream regulated gene）家族成员之一，不仅在视网膜感光细胞中特异性表达，而且具有维持感光细胞的活性、抑制感光细胞凋亡的作用。我们所获得的一系列研究结果，为视网膜退行性病变的发病机制及药物作用的靶点提供了新的思路，为最终防治视网膜退行性病变探索了新途径。因此，本项研究具有重要的科学理论意义和潜在的应用前景。