猪繁殖与呼吸综合征病毒入核蛋白与反义通路关键蛋白PSF和p54nrb相互作用的分子机制

Porcine reproductive and respiratory syndrome caused by porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) can lead to reproductive failure in sows, death in piglets and respiratory symptoms of swine in all ages, which is a serious threat to the healthy development of pig industry. We carried out proteomic analysis of MARC-145 cells infected with highly pathogenic PRRSV strain using iTRAQ technology, and found that antisense pathway was activated and significantly up-regulated. In this project we analyze the activation of antisense pathway in PRRSV-infected cells using real-time PCR, western-blotting and so on, and quantify the positive strand mRNA and antisense mRNA during cellular transcription after viral infection to determine the effect of the activation of antisense pathway on protein synthesis using strand specific transcriptome sequencing technique. Based on the over-expression and inhibited expression of antisense key proteins (PSF and p54nrb), we confirm the impact of antisense pathway on viral infection, then explore the interaction between viral proteins distributed in cell nucleus and key proteins (PSF and p54nrb) of antisense pathway using co-immunoprecipitation and confocal laser techniques to elucidate the molecular mechanism of interaction between antisense pathway and PRRSV.

猪繁殖与呼吸综合征是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）引起的以母猪繁殖障碍、仔猪死亡以及各年龄的猪呼吸道症状为特征的疾病，严重威胁着养猪业的健康发展。本课题组前期利用iTRAQ技术对PRRSV高致病性毒株感染的MARC-145细胞进行蛋白质组学分析，发现反义通路（antisense pathway）呈显著上调活化。在本项目中我们利用Real-time PCR、Western-blotting等技术分析PRRSV感染细胞后反义通路的活化情况，并利用链特异性转录组测序技术对病毒感染后细胞转录的正链mRNA和反义mRNA进行定量，确定反义通路活化对蛋白质合成的影响。通过对反义通路关键蛋白（PSF和p54nrb）进行过表达和抑制表达，分析该通路对病毒感染的影响，然后利用免疫共沉淀和激光共聚焦等技术分析病毒入核蛋白与反义通路关键蛋白的相互作用，阐明反义通路与PRRSV相互作用的分子机制。

项目以严重危害我国生猪产业的猪繁殖与呼吸综合征病毒为研究对象，按照计划任务书中明确的研究内容，开展了为期四年的研究工作。聚焦在PRRSV感染细胞后反义通路（antisense pathway）的影响，涉及两方面的研究：① PRRSV感染细胞对antisense pathway关键蛋白和antisense RNA表达量的影响；② 人工活化或抑制antisense pathway对PRRSV增殖的影响。围绕上述两方面的研究内容，开展了各项相应的研究工作，揭示了antisense pathway与不同致病力PRRSV毒株的相互作用，明晰高致病力毒株SX-1感染过程中会通过上调PSF和P54蛋白表达，活化antisense pathway，为病毒增殖创造有利的细胞环境。人工介导活化antisense pathway可以调节病毒增殖。另一方面通过揭示PRRSV NSP1α蛋白在细胞内的动态分布，发现NSP1α含具有典型的出核信号（NES），并且该出核信号在I型和II型PRRSV中保守存在。同时证实NSP1α通过与CRM-1蛋白相互作用在细胞质和细胞核中反复穿梭存在，且该核质穿梭活性是NSP1α发挥IFN-β抑制活性所必需的。通过项目的研究，揭示了在猪繁殖与呼吸综合征病毒增殖过程中反义通路（antisense pathway）的活化情况，以及antisense pathway对该病毒增殖的影响，为阐明antisense pathway在猪繁殖与呼吸综合征病毒增殖、致病过程中的机理提供了充分的科学依据，达到了预期目的。