猪繁殖与呼吸综合征病毒2b蛋白与宿主细胞蛋白相互作用研究

Porcine reproductive and respiratory syndrome virus(PRRSV), cause the severe reproductive problems in sows and high mortality in piglets, and tremendously economic losses in swine breeding industry. 2b protein is a small structural protein of PRRSV, which plays an important role during infection and replication of PRRSV.It is important for fully understanding the infection mechanism of PRRSV and figuring out the functions of 2b protein to study on the interaction of 2b protein and the host cell protein.In this study.We will firstly construct the cDNA expression library of porcine alveolar macrophages (PAM), then Screen the proteins interacting with 2b protein from the cDNA library by yeast two-hybrid system. To verify the positive proteins by yeast turning test,Translocation Fluorescence Cross-correlation tool,Co-Immunoprecipitation and GST-pull down, the antibody blocking and siRNA interference expression experiment will be carried out for the identified positive proteins, that can study the infection and multiplication of PRRSV in the porcine PAM after the inhibition of positive PAM proteins.It should be a helpful rationale for revealing the effect of 2b protein in the process of PRRSV infection.

猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）是一种引起母猪繁殖障碍和仔猪呼吸道症状并导致高死亡率的病毒，给养猪 业带来巨大的损失。2b蛋白是PRRSV的一种小结构蛋白，在病毒的感染和复制中起到关键作用。研究2b蛋白与宿 主细胞蛋白的相互作用，对全面了解PRRSV感染机制与深入认识2b蛋白功能具有重要意义。本研究首先构建猪肺泡巨噬细胞（PAM）cDNA表达文库，利用酵母双杂交技术筛选文库中与2b蛋白有相互作用的蛋白因子，通过酵母回返、双荧光共定位、免疫共沉淀法以及GST-pull down试验对阳性蛋白因子进行验证，并进一步对鉴定的阳性PAM蛋白实施抗体阻断与siRNA干扰表达，以研究阳性PAM蛋白被抑制后PRRSV在PAM上的感染与增殖情况。这将为揭示2b蛋白在PRRSV感染中所起到的作用提供理论基础。

猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）给养猪业造成了巨大的损失。2b蛋白是PRRSV的一种小结构蛋白，在PRRSV的感染和复制中起到关键作用。为了明确2b蛋白与宿主细胞蛋白是否存在互相作用，这种作用是否影响病毒的感染和复制，本项目利用SMART技术构建了猪肺泡巨噬细胞酵母双杂交cDNA文库，用含有2b蛋白基因作为钓饵载体的菌株与猪肺泡巨噬细胞（PAM） cDNA文库进行酵母双杂交，成功的筛选到了LGALS1、RPL12、LGALS3和RPS20共4种与2b蛋白互相作用的宿主细胞蛋白。我们把LGALS1作为候选蛋白，利用酵母回返试验、GST-pull down试验和免疫共沉淀试验三种方法对其与PRRSV 2b蛋白的相互作用进行了验证。通过对LGALS1进行抗体阻断和siRNA干扰，研究2b蛋白是否通过与LGALS1相互作用而介导PRRSV的感染和复制。结果显示，LGALS1的屏蔽或基因沉默对PRRSV在Marc-145中感染和增殖作用不显著，从而明确了2b蛋白与LGALS1的互相作用不影响PRRSV对宿主细胞的感染。本研究建立了一套良好的探索PRRSV与宿主细胞蛋白互作的验证方法，对今后逐步研究与揭示2b蛋白在PRRSV感染中所起到的作用提供了理论基础。