分子辅助的蛋白质高浓度超滤膜复性的机理及应用研究

An efficient refolding strategy with high protein concentration is important for quality control and process optimization during recombinant protein drug production. In this project, a cross-flow ultrafiltration process based on hollow-fiber membrane is introduced into high concentration refolding, which minimize membrane fouling and provide controllable environment. With optimized parameters of ultrafiltration operation, additives is applied to minimize adverse effects of hydrodynamics and interface chemistry on protein refolding, which improve the refolding efficiency further. With monitoring the variation of structure and activities of protein during refolding process, dynamic parameters of refolding are analyzed with the three-state model, which is used to elaborate the mechanism of cooperation of ultrafiltration and additives improve refolding efficiency. Combine the parameters of operation and dynamics with the amplification parameters of hollow-fiber, this additives assisted ultrafiltration refolding strategy is applied to pilot-scale to investigate its feasibility. In summary, this project could provide technical reference and theoretical basis for the application of this novel refolding strategy in the production of recombinant protein drug.

高效高浓度复性策略的研究对重组蛋白质药物生产中的质量控制及过程优化具有重要意义。本项目将基于中空纤维膜的切向流超滤膜过程应用于蛋白质高浓度复性操作，降低膜污染现象发生的同时为复性过程提供渐变可控的溶液环境。在对超滤操作参数优化的基础上引入复性辅助剂，削弱流体力学及界面化学效应对复性过程产生的不利影响以进一步提高复性效率。通过对超滤复性过程中蛋白质结构及活性变化规律的监测，利用蛋白质复性的三态理论模型分析复性动力学参数的变化规律，阐述超滤操作与复性辅助剂协同作用下改善高浓度复性效率的机理。将上述获得的操作参数及动力学参数与中空纤维膜超滤模块的放大参数相结合，考察添加剂辅助的高浓度超滤膜复性策略在中试规模放大应用的可行性，为该复性策略在重组蛋白质药物生产中的应用提供技术参考及理论依据。

高效高浓度复性策略的研究对重组蛋白质药物生产中的质量控制及过程优化具有重要意义。本项目将基于中空纤维膜的切向流超滤膜过程应用于蛋白质高浓度复性操作，以解决传统复性策略在生产应用中存在的问题。本项目首先在前期工作的基础上进行了超滤复性策略普适性的考察，分别考察了三种模型蛋白的超滤复性收率，通过和传统稀释复性策略的复性收率比较，证实了超滤复性的普适性。为了提高超滤复性的复性收率，随后考察了循环流速和跨膜压力两个超滤操作参数对超滤复性效果的影响。循环流速影响了中空纤维膜管内沿膜径向上的流速梯度和溶质浓度梯度，合适的循环流速可以减少复性过程蛋白质聚集体的形成；跨膜压力则影响了变性剂等小分子的去除速率，合适的跨膜压力可以为复性中间体的形成及构象重排提供渐变的溶液环境，有利于复性中间体向天然态构象的转化。因此，优化的超滤操作参数，提高了超滤复性的复性收率。为了进一步提高超滤复性的复性收率，考察了不同类型复性辅助剂在超滤复性过程中的作用效果。不同于小分子复性辅助剂，大分子复性辅助剂对于超滤复性和稀释复性的作用效果具有明显区别。聚乙二醇可以与复性中间体相互作用，超滤操作为二者的作用提供了充足的时间，使其可以发挥稳定复性中间体并促进其进入正确折叠途径以形成天然态构象的作用。葡聚糖作为渗透质，其优先水化作用引起了复性中间体不稳定性的增加，促进了中间体向天然态构象的转化。此外，葡聚糖还可以增加溶液粘度，在相同剪切力的情况下降低了溶液的剪切速率，削弱了流体剪切力对蛋白质的破坏作用。通过选择合适的大分子复性辅助剂进一步提高了超滤复性的复性收率。最后，考察了大分子复性辅助剂协助的高浓度超滤复性策略放大后的效果，其复性收率与小试的结果一致，证实了该复性策略放大应用的可行性。本项目为重组蛋白质生产中复性策略的选择和优化提供了理论和数据支持。