基于双功能配基的层析辅助蛋白质复性新方法研究

研究包涵体蛋白分离、纯化与复性的方法对于重组蛋白药物的发展具有重大的实际意义。本项目拟采用同时具有疏水基团与荷电基团的分子作为层析配基，合成新型双功能层析介质。该介质允许低盐溶液作为流动相，并利用疏水、静电等作用力的协同作用抑制变性蛋白的聚集，以辅助蛋白的复性，最后改变pH，利用静电排斥作用力提高蛋白的复性收率，有望较好地解决传统层析中存在的主要问题。同时利用计算机分子模拟技术来探索介质配基结构对蛋白复性贡献的微观机制，找出影响复性之关键因素，并为层析法辅助蛋白复性时配基结构的理性设计提供理论参考。本项目的实施可为层析法辅助蛋白复性时配基的结构做以合理的设计，并在提高变性蛋白的复性产量，降低蛋白药物的生产成本方面具有重要指导意义。

针对包涵体蛋白复性与同时纯化技术的要求，围绕着新型双功能层析技术，开展了介质制备，分离性能考察和纯化与复性的应用研究。主要成果包括三个方面：第一，新型双功能层析介质的制备：分别以琼脂糖和硅胶为基质，多种结构的小分子为配基，成功制备了新型双功能层析介质，该介质同时兼有疏水和静电等相互作用力；第二，双功能层析介质的分离性能：对于高压液相双功能层析介质而言，同时含有疏水基团和荷电基团的配基，与离子交换模式相比，其疏水模式具有更好的分辨率，这决定了双功能层析介质用于复性时优先选用疏水模式进行操作；对于中低压双功能层析介质而言，因兼有静电作用力和疏水作用力，使其在单抗药物的精细纯化领域，表现出了优异的聚集体等杂质的去除能力；第三，双功能层析介质在复性方面的应用：双功能层析介质可以成功的复性天然变性蛋白以及多种重组包涵体蛋白；就介质的配基结构而言，实验发现胍基的存在较常规阴离子交换基团更有利于蛋白复性；当同时结合静电吸引与疏水相互等作用力时，可以提高层析介质的处理量，同时更有利于提高复性的收率；如果同时再引入适当的静电排斥力，复性收率将有更明显的提高。本项目研究充分证明了双功能层析介质辅助变性蛋白复性的可行性和实用性，为蛋白复性新方法，降低复性成本等奠定了良好基础。