PgWRKY2转录因子靶向SS3和PDR3基因调控人参皂苷合成与积累的机制及优异种质构建

Transcript factors play important roles in the regulation of the secondary metabolites biosynthesis and accumulation in plant. The transcript factor PgWRKY2 involved in the regulation of PgSS3 and PgPDR3 was firstly screened by using the transcriptome sequencing from the MeJA-induced hairy roots of ginseng and identified by yeast one-hybrid system. However, the regulation mechanism of PgWRKY2 in ginsenoside biosynthesis, transportation and accumulation is still unclear. Therefore, the interaction between PgWRKY2 and the promoters of PgSS3 and PgPDR3 genes will be identified separately by using EMSA, SPR and promoter dual-luciferase reporter activity quantitative analysis. The genetically stable hairy roots and plants of ginseng harboring PgWRKY2 gene overexpression or knock-out will be constructed to investigate the roles of PgWRKY2 in the regulation of transporter and ginsenoside biosynthesis metabolic fluxes. The elite germplasm of ginseng containing much more ginsenosides will be established based on the regulation mechanism of PgWRKY2 in ginsenoside biosynthesis and accumulation in the further research. This study will provide a new theoretical basis and strategy for breeding, improving the quality and sustainable application of ginseng.

基于转录因子在调控植物次生代谢产物生物合成与积累中发挥重要作用，我们应用转录组测序和酵母单杂交等技术，率先筛选与鉴定到具有共调控人参皂苷合成关键酶PgSS3基因和人参皂苷转运蛋白PgPDR3基因转录活性的关键调节子PgWRKY2，但其共调控机制及其在人参皂苷合成与积累中的作用仍不淸楚。为此，本课题拟应用EMSA、SPR和烟草双荧光素酶报告活性分析等技术，体内外深入验证该转录因子与上述基因调控区应答元件的特异性结合及调控活性；建立稳定的PgWRKY2基因超表达和CRISPR/Cas9敲除的人参发根系和植株，结合人参皂苷代谢组的HPLC/MS分析，阐明PgWRKY2靶向PgSS3和PgPDR3基因调控人参皂苷合成与积累的机制。为进一步利用PgWRKY2调控人参皂苷药效成分为核心的优质种质资源构建奠定基础，为利用代谢工程技术培育优质人参、提升中药材及中成药品质和可持续发展与应用提供新的理论依据。

人参是我国传统名贵中草药，迄今为止，已经从人参中分离并确定了结构的人参皂苷有50余种，研究发现各皂苷单体均具有独特的药理作用，临床应用十分广泛。由于优良人参种质资源匮乏，使得高品质的人参产业化发展受到极大的限制。该项目通过MeJA/JA-Ile等诱导，对人参根等组织转录组测序，根据基因与化合物的关联性分析筛选出48个WRKY基因、3个MYB基因、11个P450基因、50余个JAs信号通路中LOX、AOC、AOS、OPR、JMT、JAR、JAZ、COI1、MYC等基因。酵母单杂交和EMSA发现PgMYB与PgDDS基因启动子具有明显的互作，SPR证实候选PgWRKY2和PgMYB2转录因子可以分别特异性结合PgSS3和PgDDS基因启动子区。明确了PgWRKY2、PgMYB2转录因子与PgSS3、PgDDS和PgPDR3基因调控区应答元件的特异性结合及调控活性。建立了PgWRKY2基因超表达的人参发根，结果发现，PgWRKY2过表达人参中，人参皂苷生物合成代谢关键酶基因PgSS、PgSE、PgDDS、PgβAS和人参皂苷转运蛋白基因PgPDR3表达水平显著提升，细胞中人参皂苷的含量增加，人参皂苷Re明显增加，总皂苷有所增加。表明PgWRKY2导致PgPDR3蛋白表达水平增加，使得候选底物人参皂苷Re被转运至细胞外在细胞间隙得以积累。亦发现PgWRKY40参与了人参皂苷的合成与积累。同时，筛选得到了4个JAR基因和3个ABCG转运蛋白基因。利用分子对接、体外表达等技术从上述基因中筛选出编码蛋白能选择性催化JA为JA-Ile的PgJAR1基因，并初步证实其能够促进人参细胞中人参皂苷的积累；采用农杆菌介导的基因瞬时超表达和SPR等技术筛选出编码蛋白能将JA-Ile转运至人参细胞核的PgABCG11基因。结果提示PgJAR1和PgABCG11是参与JA-Ile合成与转运的候选基因，该结果为利用内源性JA-Ile合成与转运促进人参皂苷积累的机制研究提供新的潜在途径。该项目的研究结果为人参遗传改良和通过合成生物学手段进行人参皂苷抗肿瘤药物活性成分生产提供重要基因资源、技术支持和理论基础，该研究结果也丰富了人参中人参皂苷生物合成代谢调控网络，具有重要的理论价值和应用前景。