灰霉病菌胁迫下番茄差异表达miRNA的识别及抗病机制研究

为了探讨灰霉病菌对番茄miRNA表达的影响，本项目拟利用Solexa测序技术及生物信息学方法识别出在正常和感病叶片中差异表达的候选miRNA基因；利用Northern杂交及定量RT-PCR技术，对候选miRNA进行确证及表达动态分析；接着，通过对差异表达miRNA所调控的靶标基因进行预测及实验验证，结合对这些miRNA上游顺式作用元件的分析结果，初步了解差异表达miRNA在番茄中的生物学功能；最后，利用转基因技术将个别差异表达miRNA导入番茄体内使其过量表达，通过对转基因植株的抗病性分析确定目标miRNA的抗病能力。本项目的执行，不但能了解 miRNA 在番茄抗灰霉病方面所起的生物学作用，而且为进一步了解番茄与灰霉病菌之间互作的调控机理奠定基础，为今后利用基因工程技术改良番茄的抗病性提供资源，同时也丰富了人们对植物miRNA应答真菌胁迫的认识，具有较高的学术价值和较强的应用价值。

本项目在国家青年基金的资助下，利用Solexa测序技术识别灰霉病菌应答miRNA。基于Solexa测序数据，首先开发了一个用于植物miRNA预测的高效程序miR_Island，其最大的优势在于用常规的工作电脑即可快速完成类似小麦这种基因组大且目前基因组拼接还不完整的植物miRNA的预测。利用miR_Island，我们从番茄中识别了植物保守miRNA共 197个，其中包括了目前44个番茄已知miRNA的31个；还有全新的番茄候选miRNA 42个。在这些miRNA中，总共发现差异表达miRNA有54个，其中45个是植物保守miRNA，9个是番茄全新候选miRNA。对这9个差异表达的全新miRNA进行Northern杂交验证，有2个miRNA表达上调，4个miRNA表达下调，其他的没有杂交信号。进一步的抗病性分析表明，有5个miRNA：miR482a、miRn018、miR169b、miRn012和miR319对灰霉病菌具有明显的抗病作用，而且miR482a和miRn018对灰霉病菌的抗病性最强。在转录水平分析miR482a和miRn018前体对灰霉病菌侵染的应答结果证明在这两个miRNA的上游启动子区应该具有应答病菌侵染的顺式元件。将miR482a和miRn018分别导入拟南芥和番茄，发现转基因拟南芥及转基因番茄的抗病性都比对照提高很多。最后我们利用自己开发的tasiRNA识别程序Phase_Miner，发现了3个番茄tasiRNA基因，其中有两个分别由miR482b和miR482d介导，剩余一个是本项目发现的番茄全新miRn032介导。抗病性研究表明，miRn032能够降低番茄对灰霉病菌的抗性，推测病菌可能通过诱导miRn032的表达，介导产生大量次级tasiRNA，进而负调控相应抗病靶基因的表达，降低番茄的抗性，达到帮助其自身入侵番茄的目的。截止目前，我们已经按要求完成了“青年基金”项目所有的研究内容，并获得了预期的研究成果。目前已经发表了3篇相关的SCI文章，共培养硕士研究生4名。