一个全新miRNA介导番茄抗灰霉病菌侵染的分子机制研究

Botrytis Cinerea is a major disease of tomato in greenhouse culturvation. We found that the novel-018, a novel tomato miRNA, has a strong resistance to Botrytis cinerea in tomato leaves in previous work supported by National Natural Science Foundation. In this project, the molecular mechanism of this miRNA resisted to Botrytis will be revealed from two aspects. The one is to find the Botrytis-responsive motif in the miRNA promoter. The other is to character the dynamic expression profiles of the miRNA and its target in tomato leaves infected Botrytis. Moreover, the transgenic tomato which are overexpression of novel-018 and have strong resistance to Botrytis will be selected for further expression profile analyzing in whole genome. According to these two aspects of results, it is expected to reveal molecular mechanism of drought resistance mediated by novel-018 in wheat. And it can also provide the genetic resources and theoretical basis for artificial cultivation of disease resistance of tomato in future.

随着设施农业的发展，番茄灰霉病已经成为保护地番茄栽培的主要病害之一。我们在前一个国家青年基金的资助下发现了一个番茄全新的miRNA- - miRn018对番茄灰霉病菌胁迫具有很强的抗性。基于上述研究基础，本项目以miRn018为研究对象，从两个方面对miRn018介导番茄抗病的分子机制进行研究：一是基于灰霉病菌侵染可诱导番茄叶片的miRn018表达上调，我们将克隆该miRNA的启动子，然后利用启动子元件缺失法，找出miRn018上游启动子区对灰霉病菌侵染的应答元件；二是基于miRn018的过量表达可抑制灰霉病菌侵染的事实，全面研究miRn018及其靶基因的表达特性，以及对比分析过量表达miRn018的转基因番茄和非转基因番茄的全基因组表达谱特征。通过上述两个方面的研究，最终将有助于我们在更深层次上理解miRn018调控番茄抗灰霉病菌的分子机理，也为未来人工培育抗病番茄提供基因资源和理论基础

本项目首先对miRn018的表达特性进行研究，发现miRn018的表达受灰霉病菌侵染而下降，其前体（pre-miRn018）的表达也受灰霉病菌侵染而下降；相反，其初级转录本（pri-miRn018）的表达却上升，表明灰霉病菌侵染可促进pri-miRn018的转录，但抑制其加工，导致pre-miRn018及miRn018的水平下降。因此，我们进一步对miRn018上游调控序列进行研究，发现miRn018启动子上存在能够应答灰霉病菌侵染的顺式调控元件，且该元件可能位于miRn018启动子区的-383 bp ~ -258 bp之间；构建miRn018的植物过量表达载体并通过农杆菌介导获取miRn018过量表达的转基因拟南芥及番茄，进一步研究发现，miRn018的过量表达下调其5个靶基因的表达，也提高了番茄或拟南芥对灰霉病菌的抗性。最后利用全基因组水平研究miRn018的过量表达对番茄其他基因表达的影响，发现miRn018的过量表达能促进NBS-LRR家族的多个成员以及其他抗病相关基因的表达。综上所述，miRn018可通过负调控靶标基因在番茄叶片中的丰度，促使多个抗病基因的在番茄体内的表达，进而提高番茄对灰霉病菌的抗性。相反，灰霉病菌侵染番茄时，通过下调miRn018的表达，达到对番茄入侵的目的。此外，本研究已经按照计划书的要求的内容，取得了预期的研究成果，并超额完成了本项目申报书所要求的研究成果。