解偶联蛋白作为动物线粒体GTP转运载体的研究

动物线粒体内的鸟苷三磷酸（GTP）是重要的能源和底物分子，最近有研究表明它还能调控胰岛beta细胞的功能。动物线粒体内的GTP由三羧酸循环产生，有研究显示动物线粒体也可从细胞质中转入GTP，但目前尚无任何研究明确指出动物线粒体上的哪种蛋白具有GTP转运功能，我们根据已有文献以及自己的初步研究结果，认为解偶联蛋白（UCP）很可能具有GTP转运功能，为进一步验证此推论，我们主要通过对哺乳动物的三种UCP和某些较低等脊椎动物的UCP进行重组表达和纯化，将它们分别制成脂蛋白体（proteoliposome），测定它们对GTP的homoexchange, uniport以及对GTP/GDP的heteroexchange活性，并比较野生型和UCP基因敲除小鼠组织中线粒体GTP的含量，从而确认动物UCP对GTP的转运活性，同时也对动物UCP（尤其是UCP2、-3）的生理功能提出新的见解。

解偶联蛋白是一类线粒体膜蛋白，属于线粒体阴离子载体蛋白超家族，哺乳动物有三种核心UCP，分别是UCP1、-2和-3，这三种UCP都能在体内催化质子渗漏。UCP1只存在于小型哺乳动物（主要是啮齿类）、人类新生儿以及冬眠哺乳动物的褐色脂肪组织（BAT），成年人和大型哺乳动物通常没有BAT，UCP1的生理功能研究地比较清楚，那就是通过催化质子渗漏来介导非震颤产热或适应性产热。UCP3主要分布于骨骼肌、心肌以及褐色脂肪，UCP2则分布于骨骼肌、心肌以及褐色脂肪以外的几乎所有类型的组织和细胞（包括胰岛β细胞），肝脏尚未发现UCP。.研究表明，线粒体是细胞中产生超氧化物和活性氧簇（ROS）的主要场所，UCP2被这些ROS激活后，通过使线粒体轻度解偶联即可显著减少ROS的产生，因此有人认为UCP2的主要生理功能是减少细胞的氧化损伤，但也有实验证明UCP2与减少氧化损伤之间并无必然联系。另外，UCP2虽然在ROS的激活下可以催化质子渗漏，甚至会因此引起胰岛β细胞功能障碍,但它们对动物体内的基础质子转运和基础代谢率却没有贡献，再加上UCP2-KO（knock-out）小鼠的表型都很微弱，使得UCP2的生理功能至今没有定论。.在所有已知的人类蛋白中，UCP2和酵母线粒体GTP/GDP转运蛋白（Ggc1）具有最高的序列同源性，此外McKee等人关于他们发现的存在于心肌线粒体的鸟嘌呤核苷酸转运蛋白的某些描述，例如丰度较低，无活性巯基等，和哺乳动物的UCP2/3比较吻合。最重要的是，我们多次测定过小鼠肾脏和脾脏线粒体（都表达UCP2）中GTP的浓度，并与UCP2-KO小鼠进行比较，发现UCP2-KO小鼠在上述组织中的线粒体GTP浓度均表现出一定程度的下降。.我们发现了UCP2在介导线粒体GDP/GTP交换中的作用。首先，在UCP2-KO小鼠的肾和脾脏线粒体中，我们发现GTP的相对含量低于野生型，而GDP的含量则相对野生型高。接下来，我们用细菌表达人UCP2蛋白并将之整合到脂质体中，证明UCP2特异性地介导了膜内GDP与外源GTP交换，而且PLP是一种有效的抑制剂。第三，利用序列比对和突变技术，鉴定了UCP2关键的功能位点。最后，我们也对UCP1功能形式的聚合状态做了研究，证明UCP1的活性是与其二聚体模式紧密相关，并且大鼠UCP1的F128和Y157对于二聚体的形成和功能执行起着关键的作用。