融合小血影蛋白模拟完整红细胞血影蛋白及HE/HPP遗传性溶血性贫血致病结构基础

血影蛋白基因突变导致95%遗传性椭圆形红细胞增多症（HE）。大部分已知与HE和热变性异形红细胞增多症(HPP)相关的血影蛋白突变都是位于四聚体位点或以未知机制扰动该位点的连接，所以四聚体位点对红细胞膜完整性至关重要。最近我们研究了血影蛋白四聚体接合位点外侧末梢HE/HPP突变对头-头连接亲和力的影响，结果显示这些突变并没有影响四聚体连接。为了揭示末梢HE/HPP点突变扰动血影蛋白骨架的机制，本项目拟设计融合小血影蛋白来模拟完整红细胞血影蛋白头-头四聚体结构（初步结果与核磁共振结构一致,发表在JBC），然后拟以融合小血影蛋白为模板，构建HE/HPP突变模型，并利用生物物理学、生物化学、生物信息学等技术研究这些突变对开放-闭合二聚体平衡和四聚体链间相互作用的影响。本项目拟阐释HE/HPP突变扰动膜骨架机制，并潜在用来改善遗传性溶血性贫血疾病的临床治疗。

血影蛋白是红细胞膜骨架的主要成分，并与肌动蛋白寡聚体、带4.1蛋白等蛋白复合体相互作用。血影蛋白位于红细胞膜下，是红细胞膜骨架的主要成分。它是柔性、长棒状蛋白，由两个亚基构成。两个亚基链为反平行排列，扭曲为麻花状，形成异二聚体。据推测当红细胞遭受剪切压力变形时，血影蛋白采取四聚体分离/再结合的“呼吸”行为来完成膜骨架动态重组。虽然二聚体-四聚体转化已经利用沉降平衡和其他方法广泛研究，但是开放和闭合二聚体在四聚体组装和膜稳定性中的作用还不清楚。血影蛋白二聚体和四聚体组装与遗传性椭圆红细胞增多症（HE）/热变性异形红细胞增多症(HPP)紧密相关。大部分已知的HE和HPP的血影蛋白四聚体形成都存在缺陷，并且多数情况下，这些与红细胞异常相关的突变都是单个氨基酸突变，并定位在四聚体连接位点。.在本项目中，我们拟表达并评估小血影蛋白重组蛋白，希望它可作为进一步研究末梢突变对亚基发卡环和闭合-开放二聚体平衡影响的模板。这个小血影蛋白也被用来评估四聚体连接位点链间相互作用的结构和功能性质，并证明融合小血影蛋白二聚体保持亚基之间正常的链间相互作用顺序。由于二聚体起始位点被移除，所以一个柔性甘氨酸链用来保证链间的相互作用。融合小血影蛋白技术上是一个单体，但我们把它作为一个小血影蛋白“二聚体”，它的头-头接合复合物作为“四聚体”，因为它们代表了缩短了的血影蛋白二聚体和四聚体。.我们提纯了小血影蛋白，经过各种生物物理仪器的分析和鉴定，确定融合小血影蛋白是完好折叠的，它们像预想的那样，侧面和侧面相互作用，从而模拟了完整血红细胞血影蛋白的二聚体-四聚体结构以及其二者平衡。在我们构建的化学交联和质谱技术结合的平台辅助下，我们鉴定了融合小血影蛋白分子间的相互作用距离，并运用生物信息学技术成功建立了小血影蛋白的三维结构模型。这个模型是当前血影蛋白最大的一个三维结构。带有C末端尾的小血影蛋白的研究结构表明，融合小血影蛋白的二聚体的构象与无（有）“尾”四聚体的构象是完全不同的，那些特异交联多肽通常与二聚体的开放/闭合构象直接相关。有趣的想象是，我们没有发现任何与C末端“尾”直接相关的化学交联多肽，因此C末端“尾”并没有表现类似0的N末端类似的灵活性，C末端“尾”对四聚体的构象并没有明显的影响。末梢突变可能通过影响链间相互作用从而导致血影蛋白稳定性进而严重溶血，这是溶血疾病的全新分子机制。