UPS/SUMO途径及其相互调节在脑缺血损伤及保护中的作用研究

一系列近期发生的重大挫折使脑保护研究陷入了困境，促使我们不得不重新审视隐藏在脑缺血损伤背后的核心机制。泛素- - -蛋白酶体系统(UPS)与其衍生的SUMO系统，分别介导ubiquitination 与sumolyation两个重要蛋白调控途径，与细胞命运密切相关。在国际上首先证实高压氧（HBO）预处理脑保护效应之后，我们深入研究发现， HBO预处理可抑制缺血损伤后异常泛素化蛋白聚集，实现保护作用，而抑制细胞SUMO化，将可逆转这一效应。提示UPS/SUMO系统功能变化及相互调节是脑缺血损伤及HBO预处理保护效应的重要条件。基于这一发现，本项目将利用MCAO及离体缺血缺氧模型，结合基因调控、Fluoro-Jade C 、多重免疫荧光染色等技术，系统阐明UPS/SUMO参与脑缺血损伤及保护效应的机制，揭示二者相互调节关系，为走出脑保护研究困境，寻找基于UPS/SUMO系统的新干预措施奠定基础。

围术期脑缺血损伤具有较高的致死率和致残率，已成为国际公认的重要医学难题。因此，针对围术期脑缺血损伤的研究已成为神经科学领域的研究重点。我们在前期的研究中发现非缺血预处理对于脑缺血再灌注损伤具有明显的神经保护作用，但其机制尚未明确。泛素——蛋白酶体系统（UPS）与其衍生的SUMO系统的发现开启了蛋白调控的新纪元，有研究报道异常泛素化蛋白聚集与神经细胞损害密切相关。因此我们推测UPS/SUMO系统可能参与调控了非缺血预处理的脑保护作用。基于这一发现，本课题从离体及在体两方面，利用在体MCAO及离体OGD模拟缺血再灌注模型，结合免疫荧光染色、Western-blot、基因调控、行为学观察等多项技术，对UPS/SUMO系统在非缺血预处理神经保护中的作用机制进行了深入研究，并获得了以下结果：1. 采用MTT以及流式细胞法观察发现，预处理对氧糖剥夺损伤的细胞具有保护作用；2. 根据TTC染色观察脑梗死面积以及神经功能学评分观察发现，非缺血预处理对脑缺血损伤的大鼠具有脑保护作用；3. 通过Western-blot结果显示，给予缺血损伤之后4小时，结合型SUMO1、Ubc9的表达明显降低，而在24小时组无明显变化；相反，结合型SUMO2/3的表达在损伤后4小时呈升高趋势，在24小时后恢复到正常水平；非缺血预处理可以逆转缺血损伤对SUMO1、SUMO2/3以及Ubc9表达的影响；4. 通过免疫荧光方法对UPS以及SUMO系统的蛋白表达进行定位，结果显示，在缺血损伤后Ubc9的表达发生核转位现象；5. 我们采用慢病毒以及siRNA转染的方法上调及下调Ubc9的表达，结果显示，过表达Ubc9可对缺血损伤的细胞及动物产生神经保护作用；然而敲除Ubc9的表达会使细胞和动物的缺血后损伤加重，并且可逆转非缺血预处理对缺血再灌注损伤的神经保护作用。通过上述研究本课题系统阐明UPS/SUMO系统参与脑缺血损伤及保护效应的机制，为寻找基于UPS/SUMO系统调节的蛋白调控新干预措施奠定基础。