真菌黑色素生物合成新途径的表达调控研究

Melanin biosynthesis is the important survival strategy for pathogenic fungi to resist environmental stress. Fungal melanins have been thought to be the products of 1,8-dihydroxylnaphthalene (DHN) and dopamine (DOPA) pathway. However, biosynthesis of water-soluble melanin (WSM) by basidiomycetous fungus Inonotus obliquus cannot be inhibited by the pathway-specific inhibitors tricyclazole or arbutin. Previous work showed that physico-chemical properties of WSM by I. obliquus is very similar to the product of a gene encoding hybrid NRPS-PKS from the fungus. Moreover, this nrps-pks formed a gene cluster with other 10 genes including those encoding protein kinase (cluster activation related),dipetidase (structure modification related) and haemolysin co-regulated protein (transmenbrane transportation related).But little is known about the biosynthetic pathway of this WSM and the information of its biological studies.Taking advantage of the toolbox of Aspergillus nidulans, this project is designed to study the following questions: 1) Analyzing domain functions of the nrps-pks and its product monomer structure with the aid of gene knock-out methodologies; 2) Searching for the machinery on activating NRP-PK melanin biosynthetic gene cluster by cloning the cluster to A. nidulans with Red/ET recombineering kit; 3) Elucidating structure modification of initially expressed product of nrps-pks using techniques of prokaryotic expression for catergorizing the biosynthetic pathway of this class of melanin, and further illuminating the mechanisms on transmenbrane transportation of the NRP-PK melanin.The results of this project will reveal a novel pathway for the biosynthesis of fungal melain, and provide new theory for the fungal survial strategy against environmental stress.

黑色素生物合成是病原真菌抵御环境胁迫的重要生存策略。真菌通过1,8-二羟基萘酚和多巴胺途径合成黑色素，但桦褐孔菌水溶性黑色素合成不受这两个途径的专化性抑制剂熊果苷或三环唑抑制。前期研究发现桦褐孔菌一杂合的非核糖体肽合成酶-聚酮合酶基因(nrps-pks)表达产物与其水溶性黑色素相似，且该nrps-pks与蛋白激酶、二肽酶及溶血素共调蛋白等10个基因形成基因簇，但尚无该类黑色素合成途径及生物学研究的信息资料。本项目拟以构巢曲霉遗传操作体系，系统开展以下研究：1) 借助基因敲除技术分析nrps-pks结构域、产物组成单元及化学结构；2) 采用基因簇克隆技术探明nrps-pks基因簇激活机制；3)利用原核表达技术阐明nrps-pks表达产物结构修饰，界定该类真菌黑色素合成的新途径，从分子水平揭示真菌黑色素合成新途径的表达调控机制，为真菌抵御环境胁迫的生存策略提供新的理论依据。

桦褐孔菌是一种分布于高纬度寒冷地区的药用担子真菌，该真菌产生的水溶性黑色素能明显改善胰岛素的敏感性、降低血脂、清除自由基以及抑制肿瘤细胞增殖的药理学活性。深层发酵培养条件下，桦褐孔菌在培养的对数后期可产生水溶性黑色素。然而，其生物合成途径和表达调控机制尚不清楚。我们在桦褐孔菌基因组注释的过程中发现一编码非核糖体肽-聚酮合成杂合酶(NRPS-PKS)基因。该基因克隆到构巢曲霉wA位点后转化子菌丝体有深褐色色素的积累。基因预测簇分析表明，编码NRPS-PKS基因与产物结构修饰、转运等10个基因组成一个基因簇。由于桦褐孔菌没有遗传操作体系, 无法阐明该基因簇与桦褐孔菌水溶性黑色素合成的关系。为此，我们将NRPS-PKS基因簇克隆到模式丝状真菌构巢曲霉的wA位点，观察NRPS-PKS基因簇在异源宿主中的表达及其代谢产物的积累研究。本项目实施期间取得以下成果：(1) 发现了桦褐孔菌参与水溶性黑色素合成的基因簇，该基因簇有10个基因组成，其中参与产物合成的基因有编码非核糖体肽-聚酮合成杂合酶和二肽酶基因；参与产物转运的基因有溶血素共调蛋白类似蛋白；该基因簇还含有与编码介导病原菌与宿主蛋白相互作用的蛋白激酶基因、tRNA异戊烯基转移酶基因以及与细胞活性相关的ATP酶家族ATPA基因。此外，还含有编码磷酸二酯类酶基因、葡萄糖磷酸变位酶类似蛋白基因以及S-腺苷甲硫氨，酸依赖性的甲基化酶基因(SAM-DMT)。(2) 构建了NRPS-PKS基因簇的构巢曲霉转化子，确定了该基因簇的产物结构为3,6-二羟基苯并芘酮酸。发现了桦褐孔菌黑色素生物合成，NRP-PK途径。确定了产物结构为一异亮氨酸与3,6-二羟基苯并芘酮形成的肽类化合物。(3) NRPS-PKS和二肽酶基因的表达受SAM-DMT基因的调控；(4) 参与产物转运的溶血素共调蛋白类似蛋白基因的表达受蛋白激酶基因调控。(5) 基因簇的初始产物在二肽酶的作用下，脂溶性的异亮氨酸被水解，产物的水溶性增加，转运到细胞外在氧化酶的作用下形成水溶性黑色素。(6) 异源表达了具有活性的二肽酶。