幽门螺杆菌不饱和脂肪酸生物合成新途径研究

Bacterial type II fatty acid synthesis system is essentially different from mammalian type I system in catalyzing enzyme structures. Meanwhile, the unsaturated fatty acid (UFA) synthesis in bacteria shows wide diversity, which provides new targets of antibacterial drugs targeting different bacteria. Helicobacter pylori genome encodes complete saturated fatty acid synthesis enzymes, but UFA synthesis pathway is unknown. Our preliminary results showed that HP0773 and HP0410 (a new gene we screened), when expressed in E. coli UFA auxotroph, conferred the activity to synthesize UFA. This project will use H. pylori strain 26695 as the study object and further use in vitro biochemical assays and in vivo knockout strategies to study the function of these two key genes and to characterize their encoded proteins. The main methods include mass spectrometry, isotope labeling TLC analysis, protein purification and in vitro recombinant fatty acid synthesis. The project aims to clarify the mechanism for H. pylori UFA C=C double bond formation, to enrich the bacterial fatty acid metabolism and its regulation mechanism and to provide a theoretical basis for the development and design of new antibacterial agents targeting H. pylori-specific fatty acid synthesis.

细菌的II型脂肪酸合成系统与哺乳动物的I型合成系统在催化反应的酶结构有着本质的区别。同时，细菌不饱和脂肪酸(UFA)合成代谢存在广泛的多样性，这为筛选和开发针对不同细菌的抗菌药物提供新的作用靶点。幽门螺杆菌(Helicobacter pylori, Hp)的基因组编码完整的饱和脂肪酸合成酶系，但UFA合成途径未知。前期研究结果表明Hp基因HP0773和我们筛选到的基因HP0410的分别表达使大肠杆菌UFA营养缺陷型菌株部分恢复了UFA合成能力。本项目以Hp模式菌株26695为研究对象，采用体外生化分析和体内基因敲除两种策略，运用质谱、同位素标记薄层分析、蛋白质纯化和重组体外脂肪酸合成等，研究这两个关键基因的功能及其编码蛋白的酶学催化机制。该项目旨在阐明Hp UFA的C=C双键的生成新机制，完善和丰富细菌脂肪酸代谢及其调控机制，为研发专一性抑制Hp脂肪酸合成代谢的新型抗菌药物提供理论基础。

细菌不饱和脂肪酸合成在不同细菌中体现多样性，为特异性抗菌药物研发可能提供新靶点。幽门螺杆菌（Helicobacter pylori, Hp）是慢性胃炎的病原体，其感染是胃癌的主要病因之一。Hp对抗生素的耐药率逐年升高，是Hp根除治疗失败的主要原因之一，因此确证新靶点研发新型抗生素是最佳的解决方案。Hp基因组编码完整的饱和脂肪酸合成酶系，但UFA合成途径及其调控机制未知。本课题以Hp模式菌株26695为研究对象，采用体外生化分析和体内基因敲除两种策略，运用质谱、同位素标记薄层分析、蛋白纯化和重组体外脂肪酸合成等多种技术手段，研究fabX在UFA生物合成中的作用、编码蛋白的酶学催化机制以及赖氨酸丙二酰化修饰对UFA生物合成的调控作用等。取得的主要成果有：（1）鉴定了细菌不饱和脂肪酸（UFA）生物合成的一条新途径，即FabX以癸脂酰ACP为底物首先脱饱和生成反-2-癸烯酰ACP，后异构化为顺-3-癸烯酰ACP作为UFA合成的分支点，完善了教科书中关于细菌脂肪酸代谢机制的内容；（2）FabX的结构生物学初步解析与定点突变分析，证实了FabX含有由四个半胱氨酸残基Cys300、Cys304、Cys308和Cys320配位的[4Fe-4S]铁硫簇，Cys300和His182是其关键的酶活位点。（3）探索赖氨酸丙二酰化修饰（Kmal）在Hp UFA生物合成的调控新机制，Kmal修饰图谱表明Hp几乎所有的脂肪酸合成相关酶都被Kmal所修饰，验证了FabX的保守位点K316是一个关键的Kmal修饰位点，对其酶活必需；（4）Hp环丙烷脂肪酸合成酶CfaS的鉴定及其生物学意义，验证了CfaS对Hp在抗酸定植、抗生素抗性以及抵抗宿主免疫中起重要作用。这些研究都表明FabX和CfaS可作为抗Hp药物筛选的新靶点。