拟穴青蟹甲基法尼酯代谢调控机制研究

The mud crab Scylla paramamosain is one of the most precious marine crabs aquacultured in China. Those female crabs with ovarian maturation, popular namely “grease crab”, possess high nutrient and commercial value. However, there is little harvest scale for “grease crab” in the whole cultured population. Research on molecular mechanisms of the regulation and controlling ovarian maturation is very important. Methyl farnesoate (MF) in crustacean is an insect juvenile hormoneanaloguethathas proven to have important role in regulating ovary development. In the present study, RACE, qRT-PCR, multiple genes expression, radiochemistry and GC/MS will be used to investigate the content of MF, gene expressions of farnesoicacid O-methyl transferase (FAMeT), juvenile hormone esterase (JHE) , juvenile hormone epoxide hydrolase (JHEH), MF binding proteins (MFBP)and vitellogenin (Vg), and enzyme activity of FAMeT, JHE and JHEH during the process of ovarian development in S. paramamosain. Besides, further studies in vitro would be done to confirm the function of FAMeT, JHE, JHEH on synthesis and degradation of MF, respectively. The regulating relationship among MF, JHE and Vg will be discussed by means of injecting inhibitor of JHE and MF. The results would provide not only clues to molecular mechanism of ovarian maturation of crustacean, but also theoretical reference for breeding high-class “grease crab” in practical production.

甲基法尼酯（MF）在甲壳动物卵巢发育中具有极其重要的调控作用，其调控效果具有浓度依赖性，阐明甲壳动物机体内MF合成和降解代谢的调节机制将有助于揭示MF浓度变化的规律，从而推进MF在甲壳类中生理功能的研究。本项目拟在克隆拟穴青蟹MF代谢的关键合成酶HMGR和FAMeT、降解酶JHE和JHEH以及结合蛋白MFBP基因的基础上，研究上述基因在卵巢发育过程中的时空表达和定位，分析MF浓度和关键酶活性的变化，并分别对FAMeT、JHE和JHEH在MF合成和降解中的功能进行验证；通过注射关键酶抑制剂和切除眼柄等正反向调控手段，解析关键酶、MF与卵巢发育之间的关系。本项目研究成果将揭示卵巢发育过程中关键酶调控MF代谢的机理，为人工调控拟穴青蟹卵巢成熟和提高膏蟹培育成功率提供科学参考，同时为甲壳动物生殖内分泌激素调控网络研究奠定理论基础。

拟穴青蟹是我国东南沿海地区主要的海产蟹类之一，隶属于甲壳纲，青蟹属。然而在青蟹养殖领域普遍存在着几个关键问题，主要包括商品蟹膏蟹及亲本培育的调控、溞状幼体到仔蟹培育的调控等。甲基法尼酯（MF）是调节甲壳类生长发育和繁殖的一种重要内分泌激素，在青蟹性成熟过程中起着至关重要的作用。本研究从分子生物学的角度，对拟穴青蟹生长发育和繁殖过程中与MF合成代谢相关的基因--JHAMT、HMGR和FAMeT、降解代谢相关的基因--JHE、JHEH和JHBP进行了克隆、表达和功能初步研究，获得1条JHAMT基因（Sp-JHAMT）、2条HMGR基因（Sp-HMGR1和Sp-HMGR2）和1条FAMeT基因（Sp-p-FAMeT）。结果显示Sp-JHAMT仅在大颚器中表达，幼体发育过程中仅在一期仔蟹中具有微量的表达，随着卵巢的发育，在大颚器中的表达逐渐升高，到V期达到最高，切除单侧眼柄后其表达呈明显的周期性变化，这说明JHAMT和MF的合成呈正相关关系。获得Sp-JHAMT纯化蛋白，结合在昆虫中的研究我们认为Sp-JHAMT在拟穴青蟹的FA合成MF的过程中起作用，Sp-p-FAMeT则可能在MF的信号途径中起作用。获得的2个HMGR基因编码产物分别是膜结合型和可溶型，这2种类型分别分布在不同组织和幼体发育中，HMGR基因的功能与个体发育特别是幼体发育的关系极为密切。获得11条JHE转录本，它们在不同组织和发育阶段具有不同的表达模式，提示它们的功能各不相同。目前对这些转录本的功能进行验证。同时获得1条JHEH和JHBP，研究了它们的基因表达，分析发现JHEH可能在MF的降解过程起关键作用，而JHBP很可能是一种甲基法尼酯结合蛋白。通过切除眼柄、MF注射等手段，研究了MF对拟穴青蟹卵巢发育的调控机制，发现MF对早期卵巢中Vg的表达具有抑制作用，上述结果从MF代谢的角度初步揭示了MF调控青蟹卵巢发育的分子网络，基本上完成任务书中的目标。