转录因子NRF2靶向调控Angiogenin的分子机制及其在非小细胞肺癌血管新生中的作用研究

Non-small cell lung carcinoma (NSCLC) accounts for 85% of all lung cancers and is the leading cause of lung cancer death. Due to the significant side effects, the current NSCLC drugs that targeting angiogenesis are limited to part of lung cancer patients. In order to find new strategy, the applicant took consideration of the high frequency mutation of KEAP1-NRF2 signaling pathway in NSCLC and screened the possible targeted angiogenesis-genes by transcription factor NRF2, and found Angiogenin (ANG). To further reveal how the transcription factor NRF2 regulates ANG transcription and thereby mediates NSCLC angiogenesis, the applicant designed this subject. In the previous work, the applicant found an ARE-like sequence in the ANG promoter region which might bind to NRF2, and this conjecture was confirmed by preliminary experiments. Next, the applicant will elaborate the transcriptional regulation mechanism of NRF2 on ANG from the level of gene molecular biology. Meanwhile, the applicant will further clarify how NRF2 regulates NSCLC angiogenesis via ANG and reveal the role of the NRF2/ANG signaling pathway in NSCLC angiogenesis from the aspect of cell biology and animal with the help of Crispr-Cas9 technology.

非小细胞肺癌（NSCLC）占肺癌总数的85%，是肺癌死亡的主要原因。由于目前靶向NSCLC血管新生的药物存在显著的副作用，导致其仅限于部分肺癌病人使用。为找寻到新的靶点，本课题针对NSCLC存在的KEAP1-NRF2信号通路的高频突变，将探索过表达转录因子NRF2可能介导的NSCLC血管新生机制。申请人前期通过基因芯片筛选出NRF2潜在调控的血管新生基因Angiogenin (ANG)，并通过实验初步证实了该ANG启动子区存在能与NRF2结合的ARE样序列。接下来，申请人将从基因分子生物学水平具体阐述NRF2对ANG的转录调控机制，并借助Crispr-Cas9技术分别从细胞生物学和动物学两个角度阐明NRF2是如何通过ANG实现对NSCLC血管新生的调控，进一步揭示NRF2/ANG信号通路在NSCLC血管新生中的作用。

非小细胞肺癌（Non-small cell lung carcinoma, NSCLC）约占肺癌总数的85%，是最常见的肺癌类型。由于大多数病人发现时已处于中晚期，五年生存率很低。NSCLC发生发展与高水平的促血管新生因子和异常的血管网络密切相关。目前针对NSCLC血管新生的治疗药物主要是针对VEGF/VEGFRs如贝伐单抗等，但由于存在明显副作用导致其仅限用于部分肺癌病人。为寻找新的靶点，本项目针对NSCLC患者存在KEAP1-NRF2信号通路的高频突变，而高水平的转录因子NRF2可能诱发NSCLC血管新生。通过体外Matrigel管型结构形成实验揭示NRF2敲除可以显著降低NSCLC促血管新生的能力，同时基因芯片筛选出ANG可能是转录因子NRF2调控血管新生的重要基因并通过qRT-PCR手段进行验证。基因ANG编码的血管生成素（Angiogenin）是最早从人体肿瘤组织中分离到的强效促血管新生因子，其高表达与多种肿瘤的发生发展密不可分。本项目通过生物信息学分析找到了基因ANG启动子区域可能存在的ARE样序列，通过构建质粒进行双荧光素酶报告基因实验发现距离ANG转录起始点上游-1010bp的ARE样序列可以与转录因子NRF2结合，后续又通过构建突变质粒、Pull-down以及ChIP实验等实验加以验证。在此过程中，我们还采用Crispr-Cas9、病毒转染等方法构建了一系列NRF2敲除(A549和H838）以及过表达(H1299)的NSCLC细胞系，以及ANG过表达的NRF2敲除细胞。通过收集野生型和基因编辑细胞的条件培养基分别开展Matrigel管型结构形成实验、划痕实验和增殖实验，揭示了NRF2通过靶向调控ANG的表达促进NSCLC血管新生。本项目研究中发现的NRF2的新靶点ANG，可以为临床治疗NSCLC血管新生提供新的思路。