胸腺上皮前体（干）细胞特异标志的筛选及功能鉴定

A functional thymus provides a specialized microenvironment for the development of T cells in which the epithelial component is indispensable for the positive and negative selection. The abnormal thymic epithelial cells (TECs) can disrupt the development of T cells and result in immunodeficiency and autoimmune disorders. An ideal strategy for TEC regeneration can enhance endogenous thymic function. It has been conformed that the cortical and the medullary epithelial cells (cTECs and mTECs) can be derived from a common epithelial progenitor cell (TEPC), and a single TEPC can give rise to a complete and functional thymic microenvironment, suggesting that TEPC-based regeneration therapies could be developed for thymus disorders. However, the lack of specific cell-surface markers has hampered the characterization of TEPC and its application. Identification and characterization of TEPCs are essential for establishing stem cell-based therapies for immunodeficiency and autoimmune. In this project, our program is to identify the specific cell-surface markers of TEPCs and investigate the mechanism of TEPC differentiation and self-renewing deeply by using the approaches of stem cell biology, molecular and cellular biology and genomics on the basis of our preliminary work. The characteristics and functions of TEPCs being isolated from the fetal and postnatal thymus using the specific markers will be conformed in both in vitro differentiation culture systems and in vivo transplantation models in details.

各种因素引起的胸腺功能受损及缺失均会引起T淋巴细胞发育异常，严重影响机体细胞免疫力。胸腺再生和功能重建是解决这一问题的理想方法。胸腺上皮细胞(TECs)为T细胞的发育成熟提供必要的微环境。研究证明，皮质及髓质TECs均来源于同一胸腺上皮前体（干）细胞(TEPCs)，且体内移植TEPCs能够重建有功能的胸腺组织。但目前仍缺乏筛选TEPCs的特异性标志，极大地限制了对TEPCs的基础研究及应用。基于我们前期工作，本课题从自主创建实验方法入手，应用干细胞生物学、分子细胞生物学以及基因组学等最新的理论与技术，筛选TEPCs特异性标志；并在体内移植模型及自行建立的TEPCs体外扩增及诱导体系中，对分选的不同细胞群体进行特性鉴定及功能分析，从而获得TEPCs特异的新标志，并对TEPCs的定向分化机制进行初步探讨，为TEPCs的生物学研究及其应用提供必要的研究手段与基础。

胸腺上皮细胞(TECs)为T 细胞的发育成熟提供必要的微环境。各种因素引起的胸腺微环境受损均会引起T 细胞发育异常。胸腺再生和功能重建是解决这一问题的理想方法。研究发现皮质及髓质TECs 均来源于同一胸腺上皮前体（干）细胞(TEPCs)，且体内移植TEPCs 能够重建有功能的胸腺组织。但缺乏TEPCs 特异性筛选标志限制了TEPCs的广泛应用。本项目中，我们以TEPCs为研究核心，自主建立TECs及TEPCs分离、培养的新方法并优化其培养体系，应用多色流式细胞仪、激光共聚焦等细胞分子生物学技术，筛选TEPCs潜在特异性标记分子，并初步探讨TECs定向分化的分子机制。首先，我们应用胶原酶二步消化法建立了胚胎期、新生及成年小鼠胸腺上皮细胞的分离方法，并采用多色流式细胞仪染色法，以EpCAM、MHC II、Aire、UEA-1 及BP-1等作为标志鉴定出TECs的不同亚群。我们还自主建立并优化了具有富集培养TEPCs特性的条件限制性体外培养体系，获得具有胸腺上皮前体细胞的特性的细胞。在此技术平台基础上，我们参照皮肤、乳腺等上皮干细胞标志，应用流式细胞仪检测体外培养的新生小鼠胸腺上皮细胞各种表面分子，发现在MTS24+的细胞中CD71的比例可达到71%。而且检测E14.5,E15.5, E17.5及新生鼠胸腺上皮细胞中CD71的表达发现，随着胎龄的增长，CD71+细胞的比例在上皮细胞中由47%逐渐降至12%，这既符合TEPC在胸腺上皮细胞中所占比例随胎龄变化的规律，提示CD71可能是TEPC的标志之一。后续，我们应用Wip1基因敲除小鼠及FSP1-TK转基因小鼠模型研究发现，磷酸酶Wip1基因具有通过p38 MAPK-CD40信号通路内源性正向调控mTEC的发育和成熟的作用，而且CD45-FSP1+成纤维细胞亚群可通过释放IL-6、FGF7和FSP1对mTECs的增值及再生发挥关键作用。本研究初步筛选TEPCs潜在特异性标记分子，并初步探讨了TECs定向分化的分子机制。