家族聚集性瘢痕疙瘩特异性标志物的筛选及功能鉴定的研究

Familial aggregation and heritability were observed in pedigreed keloids, in which scar tissue might exhibit abnormal protein expression, resulting in the change of biological traits. It is worth further studying. On the basis of preliminary study, it is proposed: ① A phage display 7/ 12-mer peptide library will be screened using fibroblasts and frozen tissue slices from pedigreed keloids as the target to obtain specific markers. ② RT-PCR, Western-blot and immunohistochemical techniques will be done to evaluate specific markers in gene transcription, translation, and expression distribution of specific markers from keloid tissue. ③ Gene silencing technology will be employed to investigate the function of specific markers: RNAi technique will be performed to inhibit the expression of specific markers. ④ ELISA technique will be used to detect the serum levels of specific markers in individual with normal skin, hypertrophic scars, randomly distributed keloids and pedigreed keloids. ⑤ An ELISA kit consist of 3～6 specific markers will be established followed with a preliminary census detection. The aim of this study was to investigate the pathogenesis and effect targets of keloids. The establishment of scar-prone detection system may serve as a strong tool in the study of keloid formation and have a broad prospect for clinical application.

家族聚集性瘢痕疙瘩具有家族聚集性和遗传性，可能存在特异性蛋白，导致其生物学性状改变，值得深入研究。本课题在前期基础上拟开展：①以家族聚集性瘢痕疙瘩成纤维细胞和冷冻组织切片为靶，筛选噬菌体随机7/12肽库，获得其特异性标志物；②应用RT-PCR、Western-blot和免疫组化技术从基因转录、翻译和表达等方面验证其大体标本特异性标志物的表达；③应用基因沉默技术鉴定特异性标志物功能：应用RNA干扰技术沉默其特异性标志物的基因，鉴定其特异性标志物的功能；④应用ELISA技术检测正常皮肤、增生性瘢痕、普通瘢痕疙瘩及家族聚集性瘢痕疙瘩患者血清中特异性标志物的水平；⑤选择3～6种特异性标志物制备多标志物复合ELISA检测试剂盒，建立瘢痕是否易发检测系统,并进行初步普查验证。期望进一步探讨瘢痕疙瘩的发生机制及防治靶点，建立瘢痕是否易发的评估诊断系统，具有重要的研究意义和广阔的应用前景。

【背景】：瘢痕疙瘩是一种病理性瘢痕，其发病机制未完全明确，缺乏有效的诊断、治疗和复发监测手段。瘢痕疙瘩具有一定的家族聚集性和遗传性，推测家族性瘢痕疙瘩可能有特异性蛋白表达谱。瘢痕疙瘩与增生性瘢痕的鉴别一般依靠临床表现，不典型病例鉴别存在一定困难。目前针对瘢痕疙瘩蛋白表达的研究并不完善，探索其特异性标志物对疾病诊断、鉴别、复发监测有着重要的意义。.【研究内容】：本课题研究以聚集性瘢痕疙瘩、散发性瘢痕疙瘩、增生性瘢痕、正常皮肤4组样本大体组织和血清为研究对象，应用同位素标记相对和绝对定量（isobaric tags for relative and absolute quantitation，iTRAQ）技术对蛋白表达量进行分析比较，对组间差异蛋白进行生物信息学分析，从大体组织标本蛋白质组学筛选结果中挑选8个蛋白，使用Western blot和免疫组织化学法行技术验证。对比大体组织和血清蛋白组学筛选结果，找出同时存在于两种样本中且表达变化较大的5种蛋白，采用酶联免疫吸附试验进行验证。拟找到特异性蛋白标志物，用于瘢痕疙瘩的诊断和鉴别。.【结果】：1、大体组织标本蛋白鉴定分析结果：四组大体标本共鉴定到蛋白质2450种，筛选出p<0.05同时变化倍数在1.2倍以上的差异蛋白，分别进行GO、KEGG注释及富集分析、聚类分析，采用Western blot和免疫组织化学法验证了8种变化较明显的蛋白，证明了iTRAQ技术的可靠性。2、血清标本蛋白鉴定分析结果：血清标本鉴定到蛋白质总数860个，筛选出p<0.05同时变化倍数在1.2倍以上的差异蛋白行生物信息学分析，并与组织块差异蛋白对比，从变化一致的蛋白中选择5种作为候选血清学蛋白标志物行ELISA验证。结果显示，Fibronection在瘢痕疙瘩及增生性瘢痕患者血清中的表达显著高于正常对照组。.【结论】 ：本课题通过采用iTRAQ技术进行瘢痕疙瘩、增生性瘢痕与正常皮肤组织及血清标本的检测，获得了4组标本的蛋白质表达谱，明确了各组之间的差异蛋白质表达情况，分析了蛋白种类功能、所在通路及相互作用情况，为找到特异性蛋白标志物，揭示瘢痕疙瘩发病机制，及临床诊断、治疗、复发检测提供了坚实的基础。