胞外分泌型人巯基氧化酶1(Es-hQSOX1b)剪接体功能及其生物药学意义探索

Sulphydryl oxidase QSOX1 is a kind of enzyme that can insert disulfide in reduced protein in multiceluler organisms. The QSOX1 gene can generate two mRNAs, secretory QSOX1b （Es-hQSOX1b）and Golgi-binding QSOX1a（Gb-hQSOX1a）. Some functions of Gb-hQSOX1a have been known, however, the functions of Es-hQSOX1b in phycological and pathycological states have been unclear. The latest research has implied that Es-hQSOX1b maybe is the biomarker of good prognosis of breast cancer. On the basis of precious work that the hQSOX1 with high activity have been prepared and the functions of mutants have been studied,the effect of Es-hQSOX1b overexpression and inhibition on stability and activity of extracellular natrix proteins, apoptosis induced by ROS will be studied by immunity, RNAi, fluorescent probe, in situ image and apoptosis detection. We hope to discover the function of Es-hQSOX1b in cancar generation and metastasis and form the basis for the discovery of new anticancer drug.

人巯基氧化酶1(hQSOX1)是多细胞生物中参与蛋白质二硫键形成的巯基氧化酶（QSOX）家族的一类酶。hQSOX1基因选择性剪接产生编码胞外分泌型（Es-hQSOX1b）和高尔基体膜结合型（Gb-hQSOX1a）两种mRNA分子。目前对胞内Gb-hQSOX1a的功能已确证，而对分泌于胞外基质的剪接体Es-hQSOX1b生理及病理功能尚不明了,最新研究推测Es-hQSOX1b可能是乳腺癌转好的一个新生物标志物。 本课题在前期制备高活性hQSOX1b和研究其不同突变体功能的基础上，拟利用免疫学、RNAi、荧光探针、细胞原位成像和细胞凋亡检测等技术，研究Es-hQSOX1b的抑制与过表达对正常细胞及癌细胞外基质主要相关蛋白结构的稳定性和酶对底物活性影响，及氧自由基产生而致细胞凋亡的作用，揭示Es-hQSOX1b对正常细胞和在癌发生及转移中的作用，发掘其生物药学价值，为癌症防治新药研发奠定基础。

人QSOX1是目前已知唯一可在一个蛋白分子的结构域之间进行电子传递的效率最高的巯基氧化酶，但其分泌于胞外基质的剪接体Es-hQSOX1b生理及病理功能尚不完全清楚。 因此，本研究旨在对其在癌细胞基质形成方面的作用与影响，及其参与蛋白质二硫键形成的生物药学应用价值进行发掘。分别从分子和细胞水平开展一系列探究，并取得相应的研究结果，以及科学知识和利用价值。具体如下内容的研究：.（1）本研究首先利用基因工程技术，对hQSOX1b的一系列的突变和截短体，进行表达和活性研究，在基本结构方面揭示了QSOX不同结构域的功能，并最终获得了具有氧化活性的最小活力单位；（2）在确定其在胞外基质中发挥作用功能单位的基础上，构建了用于转染癌细胞和正常细胞的8种载体并成功包装了病毒，构建了表达hQSOX1b功能活性单位的细胞株，研究了Es-hQSOX1b酶的活性功能域，在转化/转染不同细胞（癌细胞和哺乳动物细胞）中所发挥的氧化细胞外基质的组分的功效，从而影响基质蛋白二硫键形成与正确折叠，促进癌细胞的转移侵袭；（3）针对Es-hQSOX1b在催化过程中可以产生氧自由基而致细胞凋亡的作用，在药学利用方面，课题组还利用外源性抗氧化剂牛磺酸和TAT-SOD与抗肿瘤药阿霉素的联合作用，证实了hQSOX1b在生成活性氧（ROS）及其对癌细胞氧化还原状态和癌细胞生存活力等方面的影响，为进一步阐释生成活性氧ROS类药物的作用机制奠定基础；（4）基于hQSOX1b在蛋白质二硫键的形成和正确折叠以及促进蛋白质的活性提高中的生物学功能，课题还利用CRISPRE-Cas9技术等构建具有hQSOX1b活性的工程化细胞株CHO-K1，这使得工程化细胞内的氧化还原水平发生明显变化，有助于含二硫键蛋白质，尤其是抗体的正确折叠和活性提高，为复杂蛋白质类生物药物的高效生产奠定了基础。. 课题研究成果和创新性主要体现在hQSOX1b活性域在催化细胞外基质形成、活性氧（ROS）生成和癌细胞生存与转移等方面基本功能的初步揭示，以及其进一步应用于抗体等药物蛋白的高效折叠和高活性生产。课题开展3年期间总计发表SCI论文7篇（已标注）、申请国家发明专利3项，培养博士生1人、硕士生2人。