番木瓜eIF4E与PRSV互作机理及其抗病功能研究

番木瓜环斑病毒（PRSV）是制约番木瓜生产的主要病原。番木瓜常规的抗病品种选育难度大，以基因工程为手段的抗PRSV研究具有重大价值。目前应用的基因工程策略主要是利用病毒源基因介导的抗性，但由于抗谱窄和生物安全问题，其应用受到很大限制。病毒侵染植物依赖寄主因子的协助，真核起始因子4E（eIF4E）参与植物－病毒互作，是多种RNA病毒侵染植物的必需因子。本项目在已克隆番木瓜eIF4E基因（Cp-eIF4E）并验证其与PRSV在酵母中互作的基础上，拟通过突变不同活性部位的多个位点构建一系列Cp-eIF4E突变基因，利用双分子荧光互补技术直接在番木瓜细胞内研究它们与PRSV的互作，并通过转基因验证Cp-eIF4E突变基因的抗病性，以解析其互作及抗病机理，同时获得抗PRSV的番木瓜新种质。本研究不仅对阐明病毒－植物互作机制具有重要理论意义，而且对探索抗谱广、安全性高的病毒防治新策略具有重要实践意义。

番木瓜环斑病毒（Papaya Ringspot Virus，PRSV）引起的毁灭性病害严重威胁着番木瓜产业的发展。目前，在栽培技术上还无法通过化学药剂防治PRSV，并且番木瓜的抗病种质资源匮乏，常规的抗病品种选育难度大。因此以基因工程为手段的抗PRSV研究具有重大价值。目前应用的基因工程策略主要是利用病毒源基因介导的抗性，但由于抗谱窄等问题，其应用受到很大限制。病毒侵染植物依赖寄主因子的协助，真核起始因子4E（eIF4E）参与植物－病毒互作，是多种RNA病毒侵染植物的必需因子。本项目对番木瓜eIF4E与PRSV的互作进行研究，获得以下结果：1. 通过RT-PCR和RACE技术克隆了番木瓜的eIF4E 全长基因（Cp-eIF4E）及其异构体基因Cp-eIFiso4E，并且通过酵母双杂交和双分子荧光互补（BiFC）技术发现Cp-eIF4E和Cp-eIFiso4E均与PRSV的VPg蛋白发生互作，为以eIF4E或（和）eIFiso4E为靶点的番木瓜抗PRSV研究奠定了基础。2. 对Cp-eIF4E的结构进行了分析，通过序列比对和三维结构分析确定了6个关键位点，对这6个位点进行突变，构建了6个Cp-eIF4E单位点突变基因。通过酵母双杂交和双分子荧光互补实验发现这6个位点均影响Cp-eIF4E与PRSV的互作，初步揭示了Cp-eIF4E与PRSV的互作机理，同时获得了6个具有抗PRSV潜力的eIF4E突变基因。在构建Cp-eIF4E突变基因的同时，发明了一种能简单、方便地对质粒进行多位点突变的新方法，相关结果发表在Analytical Biochemistry。3. 分别构建了番木瓜eIF4E和eIFiso4E的干扰载体，并对植物RNAi表达载体的构建方法进行了改进和创新，发明了2种快速构建植物RNAi表达载体的新方法（包括构建能同时干扰2个基因表达的嵌合型RNAi载体），为通过干扰番木瓜eIF4E或（和）eIFiso4E基因表达而达到抗PRSV效果奠定了基础，相关结果发表在Journal of Virological Methods和PLoS ONE。本项目发表论文7篇，其中SCI收录4篇，培养研究生2名，超额完成了预期目标。