番木瓜eIF4E家族基因在PRSV侵染中的功能研究

The devastating disease caused by the papaya ringspot virus (PRSV) is a serious threat to the development of papaya industry. At present no chemicals can prevent PRSV. Furthermore, the conventional breeding of resistant varieties is difficult for papaya due to the scarcity of germplasm resources with disease-resistance. So the genetic engineering has significant value for the research of anti-PRSV. The present strategy of genetic engineering is the use of pathogen-derived resistance, but its application has been limited by the narrow spectrum of resistance and the security issues of biology. The infection of plant virus depends on the assistance of host factors. Eukaryotic initiation factor 4E (eIF4E) has been found to involve in plant - virus interaction, and is a necessary factor for infecting plants by a variety of RNA viruses. eIF4E belongs to a gene family. In the previous study, we found the interaction of both papaya eIF4E and its family member eIFiso4E with PRSV, and analyzed the interaction mechanism and the preliminary functions in the infection of PRSV by gene mutation. Therefore, the project is intended to the further studies on the spatio-temporal expression of papaya eIF4E-family genes in the process of PRSV infection, and on the subcellular localization of their proteins; furthermore, silence the two genes respectively and simultaneously by RNAi technology to study the effect on the PRSV infection. The results of this project will help to analyze the gene functions of eIF4E-family and their mechanism, and provide theoretical and practical foundation for the new strategy of anti-virus by targeting plant genes with RNAi technology.

番木瓜环斑病毒（PRSV）引起的毁灭性病害严重威胁番木瓜产业的发展。由于抗性种质匮乏，番木瓜常规的抗病品种选育难度大，以基因工程为手段的抗PRSV研究具有重大价值。目前应用的基因工程策略主要为利用病毒源基因介导的抗性，存在抗谱窄和生物安全等问题。病毒侵染植物依赖寄主因子的协助，真核翻译起始因子4E（eIF4E）是多种RNA病毒侵染植物的必需因子。eIF4E是一个基因家族，我们在前期研究中发现番木瓜eIF4E及其家族成员eIFiso4E均与PRSV互作，并通过基因突变分析了其互作机理及初步的抗病功能。因此，本项目拟进一步研究番木瓜eIF4E家族基因在PRSV侵染过程的时空表达及其蛋白的亚细胞定位，同时通过RNAi技术研究单独干扰以及同时干扰它们表达对PRSV侵染的影响，以系统地分析这2个基因在PRSV侵染中的功能及作用机制，并为利用RNAi技术靶向植物基因的病毒防治新策略提供理论和实践依据。

番木瓜环斑病毒（PRSV）引起的毁灭性病害严重威胁番木瓜产业的发展。由于抗性种质匮乏，番木瓜常规的抗病品种选育难度大，以基因工程为手段的抗PRSV研究具有重大价值。病毒侵染植物依赖寄主因子的协助，真核翻译起始因子4E（eIF4E）是多种RNA病毒侵染植物的必需因子。eIF4E是一个基因家族，我们在前期研究中发现番木瓜eIF4E及其家族成员eIFiso4E均与PRSV互作，是潜在的抗PRSV研究靶基因。因此，本项目研究了番木瓜eIF4E家族基因在PRSV侵染过程的表达及其蛋白的亚细胞定位，并通过干扰和异源超表达分析了这2个基因对PRSV侵染的影响，获得以下结果：1. 接种PRSV后，在2周内每隔1天进行荧光定量PCR检测，发现番木瓜eIF4E家族基因的表达均上升，而在对照植株中的表达平稳。2. 亚细胞定位研究发现番木瓜eIF4E家族在细胞质和细胞核中均有表达，而PRSV的VPg蛋白定位在细胞核。通过BiFC研究发现番木瓜eIF4E和eIFiso4E与PRSV-VPg的互作均定位在细胞核，并建立了一种新型的植物整合型BiFC系统以及配套的分子克隆系统。3. 优化了番木瓜原生质体瞬时转化体系，发现共转PRSV的HC-Pro（沉默抑制子）基因能显著提高转化效率。利用RNAi干扰番木瓜原生质体中eIF4E和eIFiso4E基因的表达使PRSV的表达量降低，表明PRSV侵染番木瓜需要eIF4E和eIFiso4E。4. 在普通烟草中表达番木瓜eIF4E和eIFiso4E，接种后发现转基因和非转基因烟草均不能感染PRSV，表明转入番木瓜eIF4E家族基因不能使普通烟草获得PRSV感染性。5：建立了一种简单、有效的植物病毒侵染性克隆构建方法，解决了病毒侵染性克隆在大肠杆菌中的毒性或不稳定性问题，成功构建了多种PRSV的侵染性克隆。本项目发表论文4篇，申请专利3项，培养研究生1名。