2型猪链球菌强毒株srtBCD菌毛的分子装配及生物功能研究

2型猪链球菌（SS2）是一种重要的人畜共患病原菌，我国江苏（1998）和四川（2005）曾暴发较大规模的猪群及从业人群感染，严重威胁养殖业和公共卫生安全，其高致病性的分子基础尚未阐明。通过对国内SS2强毒株全基因组注释分析，我们发现两个在结构特征上与已知革兰阳性病原菌菌毛编码基因完全一致的基因簇，分别编码一组sortase转肽酶和与已知菌毛结构蛋白同源的膜蛋白，命名为srtBCD和srtF菌毛岛，其中srtBCD岛仅存在于强毒株中。本研究拟采用同源重组构建srtBCD岛主要功能基因的敲除突变体，通过免疫电镜、免疫印迹和突变体生物特性分析，阐明该岛编码的菌毛结构蛋白的种类、定位和功能，初步解析sortase酶在菌毛结构蛋白多聚反应以及菌毛细胞壁锚定过程中的作用，探索srtBCD菌毛对高致病性SS2侵袭致病能力的影响。本研究对于全面认识国内SS2强毒株病原生物学特征和指导疫苗研制有重要意义。

1．发现SS2持家sortase A基因与细菌致病性相关，显示Sao、MRP等重要表面蛋白在srtA基因敲除突变体表面缺失，强毒力株菌毛样结构缺如，突变株对血管内皮细胞和上皮细胞的黏附能力较野生株显著下降，对动物组织的定植能力不同程度的减弱，感染动物的发病率和病死率降低。. 2．发现srtBCD基因缺失株表面菌毛样结构信号显著减弱，提示srtBCD编码产物参与细菌菌毛样结构装配，突变株对人类喉癌上皮细胞的粘附能力明显减弱。发现主要结构蛋白基因SSU2101的敲除突变株表面菌毛样结构显著减少，突变株的毒力比野生株显著减弱，表明BP是srtBCD菌毛结构蛋白组分，可能参与细菌与宿主间的相互作用，对细菌感染致病过程中起着易化作用。此外，研究发现参与srtBCD菌毛装配的3个结构蛋白（SSU2099、SSU2100和SSU2101）均具有较好的免疫保护作用。. 3．系统解析烯醇化酶的生物学功能，发现该酶不仅存在于胞浆中，还可以与具有LPXTG锚定基序的细菌表面蛋白以不同的方式呈现在细菌表面，从而参与细菌的致病性作用；证实烯醇化酶对于细菌粘附宿主细胞具有重要作用。发现基因工程制备的重组烯醇化酶具有良好的生物活性，是潜在疫苗靶分子。. 4． 研究发现，Rgg蛋白是SS2基因组中的全局调控因子。突变株△rgg的分裂发生异常，子细胞形态发生变化；突变株对Hep-2上皮细胞的粘附作用显著增强，溶血性明显增强，单对仔猪的致病性减弱。基因芯片提示，敲除rgg基因可上调蛋白质的合成与修饰、氨基酸代谢、信号传递以及噬菌体整合等，同时下调糖代谢方面的，尤其是非葡萄糖代谢过程。. 5．发现中国强毒力株潜在致病岛PAI89K可以发生天然的“切离”和“环化”，PAI89K岛编码的整合酶在此过程中发挥关键作用；PAI89K可以通过Ⅳ型分泌系统介导发生基因水平转移，初步确定PAI89K主要的致病相关基因（或调控系统）及其表达调控机制。